阿斯利康LNP-mRNA常温干燥干粉制剂，实现有效呼吸道粘膜递送

编译：Vergil

排版：三姐夫

大多数疫苗（包括批准用于COVID-19的疫苗）都应用了消化道外给药的剂型。对于这部分疫苗，几乎均需要全过程严格控制的冷链基础设施。消化道外制剂面临的其他挑战还包括：液体制剂在环境温度下不稳定；肌肉/静脉注射技能要求；患者对给药途径的担忧（针头恐惧症、注射部位疼痛、局部或全身免疫应答风险、针头/注射部位污染风险等）。

冷冻干燥是增强生物制剂稳定性的最常见方法。有报道称，由于纳米颗粒在冻干制剂复溶或递送时存在不稳定现象，且不能满足直接吸入给药，该策略尚存在一定挑战性。

可用于吸入给药的干粉制剂已被广泛应用于包括单克隆抗体、胰岛素、抗原、白细胞介素、抗菌肽等多种生物制剂，但在配制LNP-mRNA干粉制剂时，干燥过程中产生的压力源是维持制剂活性所遇到的主要问题。脆弱的LNP-mRNA在雾化过程中暴露于增加的气液接触面积，除了受到在液体膨胀和收集过程中由热脱水引起的应力外，还受到气流剪切应力，最后所得制剂往往失去有效活性。

2023年9月30日，来自阿斯利康的研发团队在J Controlled Release上在线发表了题为“Spray dried lipid nanoparticle formulations enable intratracheal delivery of mRNA”的研究论文。本项研究中，阿斯利康团队首次公开了其研发的吸入型LNP-mRNA干粉制剂的干燥工艺，并通过优化LNP配方，使制剂在常温干燥过程中仍保持稳定。此外，该方法所得的干粉制剂无需复溶，通过小鼠模型呼吸道给药，成功验证该制剂LNP-mRNA的稳定性和有效性。

配方优化克服LNP温度敏感性

一般而言，干燥过程中LNP-mRNA的功能损失主要源自于LNP配方的温度敏感性。MC3 LNP基准配方中主要使用DSPC作为辅助脂质，DSPC的熔解温度（Tm）也被称作相变温度，一般为55°C。在用于常温喷雾干燥LNP配方时，由于干燥设备出口温度接近DSPC的Tm，以DSPC为组分的LNP可能由于温度敏感性而随之崩解。相较之下，另一种常用辅助脂质DOPE的Tm则为-16°C，在干燥过程中可能更好地维持LNP稳定。

基于此，研究团队采用两种不同辅助脂质构建的LNP，并模拟干粉制剂喷雾干燥过程中经历的温度跨度，以分析表征所获得的制剂参数和LNP的有效递送能力。研究表明，以DOPE构建的LNP在高达75°C的温度下仍能维持稳定，在80°C时包封效率仅下降20%，而DSPC-LNP仅能在60°C以内维持稳定（图1A）。此外，在60°C及以上温度处理后，DSPC-LNP的eGFP表达量显著低于DOPE-LNP。在缓冲液使用方面，Tris缓冲液下DOPE-LNP较PBS具有更好的稳定性和表达效率（图1B，C）。

所得干粉可储存在4°C直至使用，相较于未经干燥处理的LNP制剂稳定性更好（图1C）。（本研究仅进行了4°C下保存两周后的稳定性表征，因此未能获知干粉制剂的最长储存时间和常温储存的稳定性。）

图1. 用于干燥制剂的LNP配方优化

在此基础上，研究人员还通过添加额外的赋形剂以保持更好的LNP和载物高温稳定性和干燥过程承受能力，并进行了优化LNP：海藻糖：表面活性三亮氨酸的实验。证实了将三亮氨酸浓度从3%增加到20%的保护作用，可以减少旋风分离器中的粉末损失，并进一步提高重组颗粒的RNA包封效率，使得LNP的浓度可以从1.5%增加到5%（图2）。但三亮氨酸浓度超过20%或LNP浓度超过7%时，产物获得率则显著降低。

图2. 赋形剂比例优化

干燥设备及工艺流程

LNP制剂首先与赋形剂溶液混合，并进入雾化装置中形成液滴。此时液滴表面保持足够的冷却和溶剂饱和，当气体被液滴产生的蒸汽饱和时，就会发生湿球温度现象使得液滴干燥过程中的表面温度显著低于装置内的干燥气体温度（∼40°C）。三叶亮氨酸在干燥过程的早期会在表面形成一个非常薄的无定形壳层，并防止LNPs到达表面并暴露在应力下。此后，蒸发减慢，将颗粒温度立即升高，粉末颗粒通过干燥器出口进入收集罐（图3）。

图3. 连续的干粉制备工艺流程

干粉LNP肺部给药后仍维持功能递送

实验设计包括四组大鼠，一组接受单剂量含有编码eGFP的mRNA的干粉LNP，另一组每天一剂连续三天接受相同制剂。作为对照，两组大鼠平行运行，每天一次连续三天或一次剂量给予安慰剂（喷雾干燥的三亮氨酸）。实验中均使用干粉吹药器给药。

肺组织切片上显示出强烈染色的eGFP阳性细胞（图4D）. 根据这些细胞的定位和形态鉴定为细支气管上皮细胞（图4D I），II型肺细胞和/或巨噬细胞（图4D II,F）。免疫荧光标记证实II型肺细胞和巨噬细胞均呈eGFP阳性。eGFP mRNA的量尽管很小（图4E III-IV），但在被鉴定为eGFP蛋白阳性的细胞类型中的分布非常密集。抗原呈递细胞（如巨噬细胞）中存在eGFP，表明吸入递送LNP mRNA疫苗可以产生适应性免疫反应，因此是疫苗递送的可行途径。

研究人员强调本研究仅进行了eGFP表达的定性研究，未进行定量研究。使用eGFP作为报告分子，通过IHC和ELISA分析证明了喷雾干燥后的mRNA稳定和表达。然而，eGFP作为外源性蛋白质，本研究中观察到的炎症变化不一定是mRNA或制剂本身引起的，仍需要采用特定靶分子进行进一步研究。

图4. eGFP mRNA的定性/功能递送研究

结论

在这项概念验证研究中，来自阿斯利康的研究团队成功通过配方优化设计出一种适合吸入给药且能在高温的干燥条件下仍维持稳定和功能性的LNP干粉制剂。其中赋形剂三亮氨酸浓度的增加可显著提高LNP干粉的产量。经体外、体内实验证实该干粉制剂能在临床使用剂量下实现LNP-mRNA的功能性递送，为吸入式LNP制剂提供了新的路径。

参考资料：

[1]Friis KP, Gracin S, Oag S, Leijon A, Sand E, Lindberg B, Lázaro-Ibáñez E, Lindqvist J, Whitehead KA, Bak A. Spray dried lipid nanoparticle formulations enable intratracheal delivery of mRNA. J Control Release. 2023 Sep 30;363:389-401. doi: 10.1016/j.jconrel.2023.09.031.

来源：RNAScript

E.N.D

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