突破衍射极限！！！

编者按

显微镜生物成像技术在生物学、医学的发展中越来越重要，目前流行的成像方法主要是依赖于对样品的荧光的收集。虽然荧光显微镜有着高灵敏度的优势，但是其空间分辨率的进一步提高往往受限于光的衍射极限（与波长、物镜焦比有关）。有鉴于此，普渡大学（Purdue University）的Prof. Ji-Xin Cheng于2013年在Nature Photonics期刊上发表了利用饱和瞬态吸收原理来突破显微镜成像的衍射极限的方法。在这篇文章中，作者巧妙地运用了激光环形输出模式自带的小空间尺寸，以及瞬态吸收（泵浦-探测，pump-probe）实验中记录信号间的差值的原理，实现了突破衍射极限的显微镜成像分辨率。笔者认为这种灵活运用（或改造）泵浦-探测技术的思维方式非常值得学习，也让我想起来本科期间大学物理实验室里流传的一句话：“会用仪器并不能算作真正的物理学家，会改造仪器才算” ，这也算是 “君子不器” 吧。接下来就让我们简要重温一遍这篇Nature Photonics。

正文

首先考虑两种泵浦-探测的方式。第一种方式，如图1a中的左边两幅图，在无泵浦的情况下，探测光有一部分被样品吸收，将样品从基态（L0）激发到激发态（L1），剩下一部分光子则透过样品；在有泵浦的情况下，泵浦光提前将一部分样品激发，从而使得样品的基态减少，激发态增加，那么当探测光达到样品时，样品对探测光的吸收减弱，更多的光子透过样品，这两次有无泵浦情况下透过的探测光光子数的差异，就是传统的泵浦-探测所得到的结果。

图1. 饱和瞬态吸收显微镜原理。a) 探测光与泵浦光与样品相互作用示意图；b) 饱和瞬态显微镜中三束光的光路示意图，三束光通过特定双色镜由左至右照射到样品表面；c) 透过样品各光束随时间的光强分布，在圆环面积内，探测光透过光强不随有无泵浦光而改变；在圆环空心区域内，探测光透过光强随有无泵浦光而改变，从而产生差值信号。

第二种方式，如图1a中的最右侧的图，无论有无泵浦，都在探测光到达样品前紧挨着加一束非常强的激发光（饱和光，saturation），强到可以使所有的样品都被激发，这样当探测光到达时，就没有任何基态样品可供激发了，因此探测光不会被吸收，而是完全透过样品。那么在这种情况下，无论有无泵浦光，透过的探测光光子数都一样，差异为0，泵浦-探测的信号也就为0。

在这以上两种方式的基础上，把这束饱和光的形状变成一个空心圆环（如图1b, 1c, 这种形状的光强分布可以通过选择激光共振腔的输出模式来实现，详见Demtröder, Wolfgang. Laser spectroscopy 1: basic principles. Springer, 2014.），那么如图1c所示，在圆环面积内（the doughnut region）就是以上所述的第二种方式，没有泵浦-探测信号，而在圆环的空心区域（the centre of the focal spot）就是第一种方式，有泵浦-探测信号，而且这个信号的空间分布的尺寸是受限于圆环内径的！当用这三束光（泵浦光，饱和光，探测光）一起逐点扫过整个样品平面时，就得到了样品的瞬态吸收信号成像图。当饱和光的圆环内径小于探测光的光斑尺寸时，该图的空间分辨率便由饱和光圆环内径决定，而不是探测光的光斑尺寸，从而实现了衍射极限的突破。

图2展示了这款饱和瞬态吸收显微镜对石墨烯纳米颗粒的成像结果。对比传统的瞬态吸收显微镜，饱和瞬态吸收技术将成像分辨率（点信号的半高全宽）从385纳米提高到225纳米，突破了仪器自身的衍射极限（300纳米）。如果使用波长更短的探测光（文中使用的探测光为830纳米），或提高饱和光的强度，那么分辨率还将进一步提升。

图2. 饱和瞬态显微镜对石墨烯纳米颗粒的成像结果以及低于衍射极限的空间分辨率。a)、b) 传统瞬态显微镜、饱和瞬态显微镜对第一批样品的成像结果，比例尺为1微米，color bar代表归一化的瞬态吸收信号强度；c) 原子力显微镜（AFM）对第一批样品的表征结果；d)、e) 传统瞬态显微镜、饱和瞬态显微镜对第二批样品的成像结果，比例尺为1微米；f) 第二批样品中箭头所指颗粒在传统瞬态、饱和瞬态显微镜下的归一化信号强度分布，饱和瞬态显微镜所得样品信号的空间分布更窄，代表更高的空间分辨率。

点评

作者在文中提过，除提高分辨率外，该方法还可以拓宽生物成像试剂的范围，因为它利用的是样品的吸收性质，而非荧光，因此可以配合使用更具生物兼容性、但不一定有荧光性质的纳米颗粒来做生物成像；另外，如果使用沿波矢方向的圆环形饱和光，则可以实现样品厚度方向的成像；而且相比于扫描隧道显微镜（STM）或AFM，瞬态显微镜不需要针尖与样品近距离接触，通过调整振镜（Galvanometer Mirrors）角度即可快速扫描整个样品。还有一点缺陷笔者想指出，因为在这种方法中必须使泵浦、饱和、探测这三束光共线才能实现突破衍射极限的分辨率，所以并不能得到传统瞬态吸收显微镜所擅长的激发态的空间分布动力学信息，比如载流子扩散动力学等，或许这就是 “鱼和熊掌不可兼得”吧。最后，希望这期文献回顾能对大家有所帮助!

关键词：衍射极限，饱和瞬态吸收

参考文献：Wang, P. et al. Far-field imaging of non-fluorescent species with subdiffraction resolution. Nature Photonics 7, 449–453 (2013).

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