病毒载体工艺开发：贴壁 vs. 悬浮培养
本文节选自《Single-Use Technologies Prove Effective for Viral Vector Process Development》，由于水平有限，详细内容，请参考原文或往期推送“一次性使用技术之于病毒载体工艺开发”。
一次性使用固定床生物反应器
贴壁工艺，最初被广泛地认为难以规模放大，因为操作空间和人力需求等因素，在最近几年，由于3D固定床生物反应器的出现，已成为一种可放大的技术。
Ram表示，这些一次性使用解决方案缓解了在终端反应器阶段贴壁工艺的操作挑战，但众所周知，在流体、细胞和试剂的均匀分布方面存在问题，因此使工艺控制具有不小的挑战性。“然而，随着市场上出现新型3D固定床生物反应器，这些担忧都得到了解决，”他说。尽管如此，Ram仍指出，与悬浮平台相比，贴壁平台仍然需要更多的操作和人力，以确保终端生物反应器之前的种子扩增链的进行。
Jourdan说，最近推出的固定床生物反应器提供了可放大的解决方案，以更工业化的方式提供高产量的贴壁工艺。“这些一次性使用生物反应器在降低占地面积的同时，提供了高细胞密度，同时提供了在线过程监测功能，以优化操作。此外，它们减少的操作体积使昂贵的培养基和其它物料(如转染试剂)的使用最优化。”
Jourdan介绍说，Univercells Technologies的一次性使用scale- X固定床生物反应器产品组合由自动化、强化的生物反应器组成，利用不同规模配置的结构化螺旋卷式固定床，以促进工艺从研发到商业化规模GMP生产的过渡。她还指出，scale-X生物反应器的设计已被证明可比用于病毒生产的其它贴壁细胞系统提供更高的产量，而在线产物浓缩可降低操作体积，并提供浓缩且澄清的收获液。
Univercells Technologies的一次性使用scale- X固定床生物反应器
在Pall iCELLis自动化、一次性使用、固定床生物反应器中，紧凑的三维固定床充满了由聚对苯二甲酸乙二醇酯微纤维组成的专利载体，为细胞在小占地设备内的生长提供了大表面积。均匀的培养基流动和独特的瀑布式供养方法结合温和的搅拌，可形成高细胞密度，获得等同于更大的搅拌罐单元的产量。该平台已用于可放大的商业化工艺的开发，包括诺华基因疗法Zolgensma和强生COVID-19病毒载体疫苗的生产。
一次性使用悬浮生物反应器
一次性使用悬浮生物反应器在病毒载体生产中越来越受欢迎。Sanderson说，新的培养基配方已经开发出来，允许HEK293贴壁细胞系直接适应无血清悬浮生长条件。已驯化适应悬液的细胞系也可以在市场上购买到。
除了这些方法外，在悬浮生物反应器中，利用固体支撑微载体上的贴壁生长条件，也偶尔开发用于生产病毒载体。其它表达系统，如工程生产细胞系和昆虫细胞/杆状病毒系统，通常使用悬浮生物反应器，因为它们是基于悬浮的细胞类型 (如Sf9、HEK293或HELA细胞)。
悬浮工艺转染效率降低以及在收获前难以去除转染试剂的挑战，导致需要仔细设计下游工艺步骤和相关分析方法，Ram说，但这些问题正在通过开发特征和性能都有所改善的新型转染试剂来解决。他还指出，其它强化工艺的努力，如高细胞密度培养，也有助于缓解这些问题。此外，Ram认为，随着该领域的发展，行业将使用稳定包装和生产细胞系来生产病毒载体，与悬浮 -转染平台相关的挑战可能就会变得不那么重要了。
与此同时，供应商的内部工作以及供应商和最终用户之间的合作正使病毒载体生产从贴壁过渡到悬浮培养，Tan说，例如，Cytiva对现有的生物反应器平台进行了细微的修改，如改进了叶轮和挡板的设计，以及使用不同的气体鼓泡尺寸，来提高转染效率。计算机流体动力学工具的使用也有助于优化流速和添加质粒的位置，以提高生产率。
一次性使用生物反应器简化
如果单个一次性使用生物反应器设计可以同时用于悬浮和贴壁细胞培养，那会如何? 这将极大地简化病毒载体生产商对设备的需求，并缓解围绕贴壁与悬浮决策的压力。
Univercells Technologies认为其NevoLine Upstream平台就是这样一个解决方案。该技术可以按高产量、低占地面积的方式适应悬浮和贴壁工艺。Jourdan称:“scale- X结构化固定床生物反应器和NevoLineUpstream平台使技术选择与工艺和规模考虑分离，提供了前所未有的灵活性。
Univercells Technologies的NevoLine Upstream平台
此外，由于NevoLine Upstream平台将细胞培养与在线中游操作(如病毒澄清、浓缩和超滤/洗滤)整合在一起，因此可以提供澄清的浓缩料液，为下游工艺做好准备。“中游单元操作的整合，大大降低了下游工艺之前的操作体积，可直接影响整体生产占地。自动化方法通过中央化工艺控制以及减少人工操作，来提高工艺的可靠性，”Jourdan说。她指出，一次性使用方面是提供高水平灵活性的关键，这种灵活性可以适应各种产品、工艺和规模。
工艺开发支持的演化
随着一次性使用技术越来越多地被用于商业化规模病毒载体的生产，对一次性使用生物反应器供应商更多支持的需求也日益增长。Cameau评论说:“在Pall，我们看到越来越多使用我们可放大生产平台的客户来寻求工艺规模放大的帮助。”她说，公司的加速器工艺开发服务小组可以根据项目的范围，在6个月到1年的时间内，提供稳健的工业规模工艺，包括过程分析技术(PAT)方法的开发。
此外，Jourdan还指出，随着行业的发展，越来越多的供应商提供基于客户工艺需求的工艺开发支持，以优化一次性使用系统的配置。“因此，”她说，“技术供应商正在努力扩大他们的产品组合，提供量身定制的全面解决方案，帮助用户规避采购、验证、供应链和存储方面的挑战。”
管理产能需求
Tan说，事实上，采购已经成为一次性使用部件和系统，以及生物药生产中使用的许多其它物料的问题。一次性使用技术已成为COVID-19疫苗加速生产的关键推动者，突然增加的产能需求给用于制造一次性使用部件的聚合物材料的供应造成了非常大的压力，这些材料也被用于生产医疗设备、个人防护用品、口罩以及包装材料。
Hitchcock说，这导致了一些一次性使用物品的材料短缺以及长达9个月的交货期，这不仅影响了生物反应器，还影响了目前依赖一次性使用系统的生产工艺的所有阶段，并已成为影响临床和商业化生产的一个全球性问题。他补充说，供应商在新的生产设施上投入了大量资金，并寻求提供额外的产能，但任何新产能的上线都需要一段时间。
龙沙工艺开发副主任Wenling Dong表示，由于一次性使用生物反应器与其它消耗品以及一次性使用生物容器组件的交付时间很长，最好的缓解策略是良好的规划。Mohindra表示，提高公司之间供需关系的透明度，也有助于解决一些特别令人担忧的问题。Ram观察到，在工艺中建立更高的灵活性，以允许使用来自多个供应商的物料和设备，并维持常见物料的库存，也是赛默飞世尔所采用的重要策略。
Jourdan认为，当前市场形势的一个好处是，它帮助提高了人们对依赖供应商整体解决方案可能带来的挑战的认识，这反过来也导致了采购方法的改变，如Ram所指出的。“在很多情况下，”她解释道，“如果已经确定了替代方案，可以降低可持续性中断的风险，那么，这确实会带来积极的回报。”然而，Jourdan也认同，这种方法确实会带来更多的复杂性，需要在物流、供应商认证和工艺验证方面付出更多的努力，这通常会使这个解决方案难以付诸实践。
过程监测的挑战
Sanderson表示，监测和控制生物反应器环境的能力已被证明能够实现更具可重复性的工艺，并提高病毒载体产物滴度以及质量/效力，包括空/完整衣壳比例。现代化一次性使用贴壁和悬浮生物反应器通常提供基本水平的过程监测和控制，包括溶氧、pH、温度等。
此外，Sanderson指出，整个行业的供应商都在研究新型PAT工具和传感器的使用，如拉曼光谱、碳酸盐和葡萄糖传感器，以加强过程监控和控制策略。
然而，目前，Mohindra指出，过程监测的需要意味着外部探针(pH，溶氧张力)必须经过高压灭菌，然后以无菌方式插入一次性使用容器中。
对于工作体积小于50 L的小型罐，这种操作通常必须在生物安全柜(BSC)内进行。Mohindra说，由于探针的长度和可用空间有限，这很容易出错。
在更大的规模条件下，一次性使用无菌接头确实允许高压灭菌探针在BSC外以无菌方式插入一次性使用罐中。然而，Mohindra说，这些解决方案并不理想，因为安装不当或压力过大可能导致接头损坏和工艺失败。
Mohindra总结道:“这些挑战凸显了将一次性使用传感器集成到一次性使用反应袋中的需求。” 他指出，虽然已经取得了一些进展，但传感器的发展仍有余地以更精确的方式测量更多的过程变量。
Ram补充说，最终实时PAT可能是决定病毒载体生产商选择悬浮细胞培养还是贴壁细胞培养的因素。他说:“许多这些技术都是在基于悬浮平台的单克隆抗体生产背景下设计的，因此，采用现有的PAT生产病毒载体，可能更容易在基于悬浮的平台上实现。” Tan说，目前针对滴度比较的分析方法缺乏标准化，阻碍了对现有上游技术的有效评估。
使用大规模一次性使用技术的挑战
尽管一次性使用技术的优点大于缺点，但使用一次性使用系统仍面临一些独特的挑战，特别是在大规模使用时。Ram说，在商业化规模的病毒载体生产中实施一次性使用系统的关键问题之一是产生过多的生物危害性干/半干废物，这不仅涉及材料本身，还涉及其包装。与辐照灭菌材料无菌性有关的保质期是另一个制定运营计划时需要考虑的问题。
Ram表示，大规模的一次性使用系统在将一次性使用培养袋安装到设备以及拆卸时也存在挑战，泄漏风险更高，此外，还需要增加存储一次性使用物料的仓库空间。
展望
Cameau断言，工艺整体的稳健性是最重要的考虑因素，整个行业都在继续努力工艺，以克服先进疗法商业化的挑战。
例如，Cameau指出，在采用一次性使用技术时，溶出性和析出性仍然是一个问题。此外，还需要进一步了解上游生产工艺对AAV的完整/空衣壳比的影响。她说:“可能有一些参数可以用来更好地控制这个比例，我们每天都在朝着这些解决方案努力。”
此外，Cameau表示，一些载体对剪切、光照、泡沫敏感，或在进入细胞凋亡时容易被细胞释放的蛋白酶降解。“在规模放大时，无论平台选择什么，应用正确的规模放大策略，以获得可再现和可放大的结果，有时都是极具挑战性的。这一困难可能导致从扁平器皿过渡到生物反应器时，无论是搅拌罐悬浮培养或固定床类型的生物反应器时，滴度较低。需要更多地了解针对特定病毒载体类型的适当规模缩放策略。”
Jourdan表示，在快速增长的基因治疗领域，对上市速度的强调也为技术供应商提供了一个机会，提供有价值的、可持续的解决方案，帮助病毒载体生产商促进工艺优化和可放大性，并降低商品成本。”
例如，一次性使用技术在纯化特定产物时，在压力和流速方面，存在一定的挑战，在离心力、温度以及由于鼓泡设计而导致的氧气和二氧化碳脱除率等方面也存在局限性，Mohindra希望供应商能够解决这些问题。与此同时，Ram希望看到用于种子扩增的平底器皿混合技术的改进，或建立用于种子扩增的全新方法，以实现更高培养均一性和一致性。
Sanderson观察到，采用先进的PAT工具不仅可以改善过程监控，还可以实现工艺强化策略，包括在贴壁和悬浮系统中的连续生产(灌流)。Cameau说，灌流策略可以帮助减少由于生物反应器中“外部攻击”而导致的载体滴度损失。
最后，Tan指出，在最终用户中有一个普遍的共识，即基因治疗和基因修饰细胞治疗的下一个创新将是实现稳定的病毒载体生产细胞株，结合使用大型一次性使用生物反应器，以提高滴度，降低成本。
原文：C. Challener,“Single-Use Technologies Prove Effective for Viral Vector Process Development,”BioPharm International, 34(8) 2021.
相关阅读：