如何制备2亿剂mRNA疫苗：LNP制剂 - mRNA的包封
本文节选自来自美国宾州大学的研究人员发表的文章“Manufacturing Strategy for the Production of 200 Million Sterile Doses of an mRNA Vaccine forCOVID-19”，由于水平有限，详细内容，请参考原文或往期推送“如何制备2亿剂mRNA疫苗：mRNA的合成和纯化”。
LNP制剂：mRNA的包封
料液准备
每台微流控设备都有两股进样液流；一股进样液流含有处于水性缓冲液中的mRNA，另一股进样液流含有溶解在乙醇中的脂质。每个液流中成分的浓度对形成的脂质纳米颗粒(LNP)的粒径以及有效的mRNA包封都很重要。因此，这些溶液的制备是必须在微流控步骤之前进行的重要步骤。
脂质溶液的制备包括将总共14 kg四种脂质(ALC-0315、ALC-0159、DSPC和胆固醇)溶解在1200 L乙醇中，得到脂质浓度为10mg/mL的溶液。
mRNA溶液将经过所有的mRNA纯化步骤，并处于50 mM醋酸钠溶液中；mRNA必须处于酸性缓冲液中，如醋酸钠，这样才能保证mRNA的包封。然而，mRNA纯化步骤产生的mRNA溶液中所含有的mRNA浓度过高，无法进行下一个微流控步骤。因此，用额外的3,600 L 50 mM醋酸钠稀释mRNA，以达到微流控所需的浓度，即0.13 mg/mL。
LNP制剂：微流控
交错人字形微流控混合设备将用于生产含mRNA的LNP；设备的示意图如下图所示。一股进样液流为处于酸性缓冲液中的mRNA，另一股进样液流为溶解在乙醇中的脂质。两股进样液流在混合通道中相遇，混合以及LNP形成以微秒量级发生。这些微流控芯片设备由25组16个并行芯片组成，或25个16X系统。这些液体将从mRNA水性溶液和脂质溶液的储存罐中泵入每台微流控设备。
为了确保mRNA在整个过程中的稳定性，这个微流步骤将在4℃进行。mRNA将通过一股进样液流流入，其处于pH 4.0的醋酸钠缓冲液中，浓度为0.13 mg/mL。对于单台设备，mRNA液流的流速为9 mL/min。此外，处于乙醇中的脂质以10 mg/mL的浓度流入，单台设备的脂质流速为3 mL/min。这表示流速比(FRR)为3:1 (mRNA:脂质)，这是此前文献所推荐的。这些液流将在混合通道相遇，在那里，混合将在3毫秒的过程中发生，单股液流将以12 ml/min的流速退出单个设备。使用这些设备，生产一周的产品 (一批或500g mRNA) 需要19个小时。
交错人字形微流控混合设备。这些设备可以并行运行，从而使工艺可放大
LNP的纯化：切向流过滤
在微流控设备之后，mRNA链现在被包封在LNP中。然而，现在有必要去除由于微流步骤而出现在溶液中的不需要的污染物。必须去除从微流控设备流出的溶液中不需要的污染物，因为它们不会出现在最终的药物制剂中，包括：乙醇和醋酸钠。类似于IVT反应器和层析柱之后所做的，切向流动过滤步骤是必要的，以从LNP – RNA产物中去除这些污染物。
因此，在微流控设备之后，产物溶液首先用切向流动过滤装置 (在我们的工艺中也称为TFF3)进行纯化。这个单元操作的目的是去除除LNP – mNA产物之外的所有元素，并进行缓冲液置换。为了确保LNP - RNA产物被纯化，我们选择了截留分子量 (MWCO) 为100 kDa的超滤膜。所选膜孔的大小可确保LNP- RNA产物不能通过过滤器。用于此工艺的缓冲液选择1XPBS缓冲液，因为这将针对下游进行的最终稀释工艺准备好LNP- RNA溶液。此外，PBS缓冲液在疫苗的最终制剂中，这也是为什么选择PBS作为TFF3缓冲液的另一个原因。PBS缓冲液由氯化钾、磷酸二氢钾、氯化钠、磷酸二钠水合物组成。根据专利建议，TFF3将使用10倍洗滤体积(DV)的PBS进行。由于从微流控设备流出的产物溶液的体积约为4,935 L，这意味着使用10 DV的这一工艺所需的缓冲液体积将为49,350 L。TFF3的截留液将包括脂质、mRNA和PBS。截留液的体积选择为626 L，因为我们想在mRNA溶液进入最终稀释工艺之前将其浓缩。这意味着TFF3的滤液体积约为53,035 L。TFF3的滤液将包括：醋酸钠、乙醇和PBS。TFF3的通量设定为82.5 L/h/m2，符合专利的建议。此外，工艺时间设置为7.5小时。TFF3的工艺时间比TFF1和TFF2要长，因为需要处理的体积比较大。根据确定的工艺变量，计算出膜面积为86.72 m2，流速为7,155 L/hr。另外，我们假设98%的LNP- RNA产物将在截留液中回收。这意味着495 g的mRNA进入TFF3，截留液中回收485 g。在这一步骤中，每升料液中的mRNA浓度从0.0092 g增加到2.65g。（原文如此，不知是否理解有误或遗漏细节）。
LNP的纯化：除菌过滤
在我们的工艺中，LNP - mRNA溶液离开切向流过滤系统后，使用除菌过滤装置进行过滤。溶液的除菌过滤是整个工艺中最后的纯化步骤。除菌过滤的目的是通过去除被过滤样品中的所有细菌和微生物污染，确保LNP-mRNA产物是无菌的。除菌过滤步骤非常重要，因为它确保了我们的最终产品是无菌的，这是必要的质量要求，因为它将被注射到人体中。在这一步的生产过程中，mRNA产品将使用0.2µm膜（Opticap Sterile XLT10 Millipore Express过滤器）直接过滤在最后的存储容器中。过滤器为一次性使用，由于其尺寸，TFF3获得的每批次LNP-mRNA产物使用一个过滤器。预期过滤器的产物回收率将为100%。
原文：I.Labarta, S.Hoffman, A.Simpkins, Manufacturing Strategy for the Production of 200 Million Sterile Doses of an mRNA Vaccine for COVID-19. 2021.
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