rAAV基因治疗需要的创新：AAV衣壳
本文节选自对Asklepios Biopharmaceuticals（AskBio）研发主管Lester Suarez博士的专访，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
问：你们现在在做什么？
LS：我的团队正在研究rAAV载体生物学的许多不同方面，包括宿主-rAAV相互作用以及宿主对rAAV衣壳的免疫反应的结果。我的团队的主要目标之一是制备新的rAAV异构体，使其可以有效地穿过血脑屏障(BBB)，同时避免预先存在的免疫。这种衣壳的成功开发可能使神经退行性疾病的治疗成为可能，且只需简单的标准静脉注射，而无需预先进行免疫筛查。除了提高载体的靶向能力外，我们还在推进宿主- rAAV在同一衣壳中相互作用不同方面的合成协同进化。我们不断创新rAAV技术，从而为患者带来最有效、最安全的治疗方法。
问：作为一个整体来看，基于AAV的基因治疗在最近几年经历了一段起起伏伏的时间 – 您如何总结目前的情况？
LS：自从DNA重组技术为人类带来了一个新时代 - 现代基因工程的诞生以来，已经过去了近50年，而我们每天仍在学习和改进这项技术。
基因工程，结合不同的基因递送方法，使得通过将遗传物质(DNA和/或RNA)递送到我们的细胞中，从而直接操纵和改写我们自己的基因组成为可能。它本质上是把我们自己的身体作为一个活的生物反应器。这真的是一个了不起的创新。这一过程可能将是治疗或预防疾病、修复器官或组织以及重新编程细胞老化过程的“最终前沿”。这种进步可能会改变人类应对疾病和健康的方式。
AAV进入细胞和递送遗传物质的“自然”能力被用来将治疗性基因传输到目标组织。rAAV作为一种基因递送载体，为探索医学的许多“最终前沿”打开了大门。不幸的是，尽管存在一些常见的误解，rAAV并不仅仅是一个围绕4.7 kb单链基因组的“蛋白质盾牌”。rAAV是一种重组“病毒”，我们的身体已经准备好对抗它了! 我们的免疫系统对使用rAAV治疗疾病造成了多个挑战。
生命是病原体和免疫系统为了生存而进行的一场持续的微观战斗。自数百万年前人类首次进化以来，人类的免疫系统经历了很多变化，这仍然是基于rAAV的基因治疗在今天面临的最大挑战之一。人体内rAAV载体的系统性给药与针对rAAV衣壳蛋白触发的体液和细胞免疫反应有关。rAAV疗法也能引发针对治疗性转基因产品的免疫反应。
UniQure的Glybera(基于AAV1载体)、Spark的Luxturna(基于AAV2载体)和诺华公司的Zolgensma(基于AAV9载体)是第一批经过临床开发并获得批准的成功基因治疗药物。处于临床开发中的rAAV基因疗法还有很多。随着更多的项目通过临床推进，出现了一些基于临床前动物研究的未被预料到的问题。
那么，我们还必须克服哪些挑战，才能为患者带来更多的基因疗法？这些患者往往面临着毁灭性的疾病，没有治疗选择。挑战可分为两类：(i)发展对衣壳的理解；(ii)提高治疗方法的安全性。
首先，我们对AAV衣壳对人体影响的认识还在不断发展。AAV衣壳是治疗性基因盒和整个机体之间的界面，设计成功的治疗性rAAV基因递送必须考虑衣壳的许多不同且复杂的方面：
自然趋向性；
转导效率；
组织渗透；
生产系统和翻译后修改（PTM）；
在血液流中的持久性；
与先天免疫系统和内/溶酶体酶的相互作用；
贩运网络；
衣壳分解 vs. 核衣壳保留；以及
AAV衣壳降解途径vs.抗原呈递 – 当然还有其它方面!
rAAV载体并不完美（至少目前不是），所以我们必须继续创新…仍需开发新的衣壳。此外，我们对rAAV衣壳生物学和动力学的认识还存在很大的差距，特别是在某些血清型中，对rAAV衣壳的认识可能比其它血清型多，而且仅限于特定的物种。
其次，如今在安全性和有效性之间似乎存在着一种平衡。关注基因治疗的安全性是很常见的，因为患者的安全是最重要的。不幸的是，野生型AAV血清型在基因治疗中往往表现出整体的低效率。达到更高的效率往往需要使用更大的剂量，并克服关键衣壳限制，如不良的转导和组织渗透。然而，更高的剂量可能受到越来越多的安全担忧的影响。虽然基因治疗的安全性必须始终是首要考虑因素，但我们必须继续创新，以便设计出对患者有效的rAAV治疗方案。
在过去的几年里，基因治疗领域看到了rAAV基因治疗在临床阶段严重不良事件的增加。在某些情况下，患者的死亡与高剂量和/或免疫并发症有关。最近，FDA对rAAV载体的致癌性整合提出了关注。为达到治疗效果而使用的高剂量基因疗法，在许多情况下不是正确的方法，并可能有几个负面影响：
生产能力；
产生强烈的免疫反应；
器官损伤；和
致癌整合的可能性
大方向是清楚的。至关重要的是，我们要继续创新和提高rAAV载体的疗效，这样我们就可以使高剂量基因疗法变得不那么必要。幸运的是，有许多潜在的方法可以实现这一点。
我的团队正在进行这项工作，创造一种新型的合成AAV衣壳，以满足不同的需求。我认为新型合成AAV衣壳有更多的用途，但它们的开发是一个缓慢而困难的过程。野生型AAV血清型是一个非常好的模板，但如果没有创新和自我挑战，我们将仍然被困在同样的循环中，面临同样的问题、限制和可能的相似结果。我们意识到，许多患者没有时间，对他们来说，接受使用旧衣壳技术的非最佳治疗可能比根本不接受治疗要好。但新型合成AAV衣壳的兴起必须成为我们推进衣壳创新的重点。我们的重点不是让高剂量变得安全 - 我们需要让高剂量变得“没有必要”。
问：在解决AAV载体领域的各种挑战方面，您具体看到了哪些进展？
LS：人体rAAV基因递送长期以来一直是一种令人信服但又难以捉摸的治疗方法，其最初的重点是治疗危及生命的罕见遗传疾病。然而，在AskBio，我们认为在未来，rAAV基因递送可以用于更常见的疾病。尽管在一些临床试验中，rAAV载体已经证明了安全性和长期有效性，但与人体免疫系统(先天免疫和适应性免疫反应)相关的问题仍然是基于AAV的治疗方法能够被更广泛应用的一个重大挑战。
先天性免疫是一种针对病原体(如AAV)的快速和非特异性的第一道防御机制。它也对特定的病原体特异性适应性免疫反应的形成具有指导作用。目前已经描述了三种AAV相关的先天配体及其对应的模式识别受体：
Toll样受体-2（TLR2）对AAV/rAAV衣壳的感知；
TLR9对rAAV基因组中未甲基化CpG二核苷酸的识别；和
双链RNA (dsRNA)作为AAV倒置末端重复序列(ITRs)固有的启动子活性，激活细胞质MDA5传感器
有证据表明，这些受体 - 以及其它可能的受体 - 感知AAV/rAAV，刺激促炎细胞因子和I型干扰素的表达，并促进有效的适应性免疫反应，包括体液免疫(B细胞)和细胞介导免疫(CD4+和CD8+ T细胞)。因此，记忆AAV/rAAV特异性B和T细胞可能会持续患者一生，并在体内rAAV载体给药后被“唤醒”。这是预先存在的免疫。
即使在低滴度的情况下，对rAAV衣壳原有的体液免疫也会通过中和rAAV载体而限制rAAV基因递送的效果，而记忆性淋巴细胞也会被重新激活，导致抗AAV抗体的从头产生。已有的抗AAV中和抗体(NAb)是人体中成功系统性载体给药的第一个障碍。此外，已经存在的抗AAV抗体正被研究为与补体激活相关的潜在毒性来源。针对rAAV衣壳的特异性B和T细胞可能通过破坏递呈衣壳源性多肽的转导细胞而导致转基因表达的丢失，以及其它免疫介导的不良反应，从而限制了患者基因递送的安全性和有效性。
克服NAb的挑战的一个方法是血浆置换，去除抗体和其它抑制因子。不幸的是，血浆置换可能导致低γ球蛋白血症，并可能增加感染的风险(如COVID-19)，以及与rAAV病毒颗粒直接相互作用并增强rAAV转导的血清蛋白的减少。另一方面，
IgG裂解内肽酶(如IdeS和IdeZ)快速清除循环中的抗AAV免疫球蛋白和/或
蛋白M作为抗体的通用诱饵是一种临床应用策略，在患者rAAV给药前，误导或迅速降解预先存在的抗AAV NAb。
然而，虽然这些方法可以“关闭”预先存在的体液免疫，但通常不会去除其它血清转导抑制剂蛋白，如半乳糖3结合蛋白(G3BP)。
全身使用糖皮质激素已被作为一种药理策略，以抑制人体对rAAV基因治疗的免疫反应。糖皮质激素通过减少促炎细胞因子和趋化因子，以及T细胞和b细胞的产生，对先天和适应性免疫细胞有广泛的抑制作用。然而，目前的药理策略要么是无效的，要么有不良的副作用，只能作为一个暂时的解决办法。
随着基因治疗领域的迅速发展，可能会有更多的rAAV疗法靶向越来越多的遗传疾病，克服预先存在的体液免疫挑战的策略必须更有效且经济可行。
在AskBio，我们对此进行了大量的研究。优化载体设计，例如从rAAV基因组中去除免疫刺激CpG基序以避免TLR9激活，是我们正在探索的克服先天免疫的方法。然而，这只是整体工作的一部分。关于预先存在的体液免疫，我们的目标很明显，AAV衣壳。我们正在研究下一代合理设计的AAV衣壳，其将具有增强的NAb逃避。我们的想法是在非人类AAV衣壳中引入突变，以防止与患者体内预先存在的交叉反应性NAb的结合。AskBio专注于这种合理衣壳设计方法，当然也包括其它方法，以优化衣壳设计。
我们考虑的另一个方面是假设rAAV载体的免疫原性是剂量依赖性的。为了避免免疫介导的不良反应以及“剂量依赖性载体免疫原性”，我们知道我们需要更高效的AAV衣壳来将治疗性基因盒递送到目标组织。我们针对载体靶向的合成AAV衣壳能够精确地响应更高的细胞转导和组织渗透功效的需求，并以更低的剂量，优化生物分布。载体生物分布是我们的关键。我们知道，AAV衣壳蛋白等抗原蛋白的定位可能会影响抗原呈递以及B和T细胞免疫应答，这将限制rAAV载体未来的再给药。
rAAV基因治疗载体的再给药是rAAV基因治疗领域最具雄心和挑战性的目标之一。然而，这是我们必须解决的一个关键挑战，特别是当我们开发用于治疗儿童终身疾病的基因疗法时。目前市场上的基因疗法使用高剂量，会引发免疫反应，以目前的知识和治疗方法，几乎不可能成功地进行免疫调节。我们的免疫系统非常复杂，可以抵御内部和外部的威胁 -这是一种强大的生物机制。我们解决再给药挑战的方法之一是肝脏耐受性反应的反卷积。肝脏是一个具有显著免疫调节机制的耐受性器官，对器官移植有利，对慢性感染性肝病或肿瘤的发生有害。高剂量基因治疗和未优化的生物分布的结合可能绕过了这种耐受性过程，我们应该能够利用这一优势。只有完全控制适应性免疫反应，才能成功地实现rAAV载体再给药。这将通过与新型合成AAV衣壳相结合的耐受性反应来介导，这种衣壳将具有优化的生物分布、增强的NAb逃逸且没有天然配体。这不是一项不可能完成的任务。对于患者来说，这是一个必须克服的挑战。
问：您能告诉我们更多关于AskBio明年的研发重点和目标吗？
LS：我们正在研究许多不同的rAAV平台、项目、优先级和目标。创新和多任务处理是我们在AskBio每天的生活和呼吸。明年，我和我的团队将专注于AAV衣壳的发现/表征，以及合成Doggybone™DNA (dbDNA™)技术。
开发新型合成AAV衣壳始终是我们的首要任务。特别是，我们专注于开发免疫原性较低的衣壳，增强原有的免疫逃避和转导。我们对新型衣壳及其与特定受体的相互作用的理解越来越深入，因此，我们的科学每天都在进步。我们的一个关键领域是通过静脉(IV)给药的CNS定向rAAV基因治疗。为了实现这一目标，我们已经选择了几种人体受体作为靶向，我们正在进行表征和学习。我们知道自己想要什么，并专注于它。
另一方面，我们的“工具箱”衣壳技术在过去的几年里已经有了显著的发展，这是将科学推向患者精确需求的结果。AskBio实现差异化的一种方式是，我们知道我们的目标受体，我们可以预测生物分布以及衣壳在不同物种中的功能性。我们通过预先选择的受体介导的合理生物分布来实现这一点。这项技术让我们能够创造更好的动物模型，比如人源化小鼠模型，来测试我们新型合成AAV衣壳，并回答特定的问题。另一个重要的方面是，我们正在对新的AAV衣壳的不同方面进行共同进化，比如逃避现有的体液免疫，同时增强CNS定向靶向。这一过程的复杂性相当大，且非常缓慢，但是我们有一个出色的团队，在AskBio的领导团队中包括了一些基因疗法的先驱 – 比如Jude Samulski和Katherine High，我们都受到科学和帮助满足患者需要的动力所驱动。
虽然衣壳是我们的首要任务之一，但我们也对衣壳内部的东西感兴趣，它们的设计以及我们如何以更可靠、更有效、更安全、更可持续的方式生产它：重组AAV基因组。合成AAV生物学是一个新兴的跨学科领域，涉及AAV所有部件的重新设计，包括衣壳、包装的基因组以及生产rAAV所需的起始材料。rAAV载体用于治疗的主要障碍之一是缺乏高效的生产工艺。三质粒转染是最流行的生产方法之一，它依赖于质粒编码三种成分：
腺病毒辅助功能；
Rep-Cap功能；和
重组AAV基因组
用于生产rAAV的质粒DNA的生产和使用面临着若干重大挑战，包括可放大性、高成本、对患者安全的潜在风险、GMP生产的前置时间长，以及经常导致质粒骨架源性DNA序列共包装至最终载体制剂。所有这些挑战都可以通过人工合成DNA技术的创新来解决，我们在AskBio率先推出了人工合成dbDNA™技术。dbDNA不依赖于基于细菌发酵的DNA合成，相对于质粒生成，提供了更快的生产和更快的可放大性。dbDNA工艺在提供相同的质粒DNA治疗有效载荷的同时，也消除了转染物料中的细菌骨干。这项技术可以让我们通过加快生产速度、降低成本、从AAV生产过程和最终产品中消除抗生素耐药性基因，以及产生一种生产病毒所需的新型起始物料，来治疗更多的患者。我们将推动dbDNA在未来的临床应用。
问：展望2022年及以后，您能总结一下在改进AAV驱动的基因治疗的工作中，对您来说下一步创新的关键步骤是什么吗？
LS：在AAV基因治疗中，有持续创新的显著需要：1)-更有效的AAV衣壳；2)-更有效的治疗性基因盒；3)-更高效的生产系统。然而，在短期内，我可以看到许多创新来自于1)-核酸领域和2)- AAV结构生物学。
在不到5年的时间里，与rAAV很近的核酸领域已经明显成熟。一个最简单也是最显著的例子是，我们可以利用Touchlight公司的dbDNA技术来制造rAAV生产所需的起始物料。这种体外合成扩增工艺能够在短短几周内生产出数克规模的GMPDNA。另一个例子是GENEWIZ开创性的AAV服务，包括序列验证和ITR区域校正。GENEWIZ的ITR测序可以很容易地通读ITR，与非AAV测序反应相当，从而判断其完整性。ITR对rAAV包装和生产至关重要，但截断或突变的ITR会导致产量下降。这两项技术对AAV基因治疗领域来说都是一个重大的时刻，这使我们能够开启rAAV产生和ITR生物学的新研究方法。预计它将提供一种更安全、更有效、更可放大和更快的rAAV生产方式，同时由于对ITR质量控制的更好支持，rAAV产量将增加，成本也将降低。
正如核酸领域的发展一样，衣壳领域也在不断成熟。可用于发现具有所需特性的AAV异构体（如特定的目标组织）的高通量方法一直在高速发展。高通量筛选条形码AAV衣壳文库和高通量长读测序，为从具有独特抗体规避特性的特定组织中发现新的AAV衣壳提供了机会。然而，在我看来，结构生物信息学将推动基因治疗的未来。
结构生物学和机器学习的进步是显著的，这将有助于解锁宿主-rAAV相互作用的结果：从衣壳组装到生产途径，再到体内给药，以及更有效的治疗性转基因产品的合理生成。
随着谷歌旗下DeepMind项目AlphaFold 2在2020年12月的发布，结构生物学和基因治疗领域可能会发生巨大变化。这可能会显著增加结合蛋白质结构测定和更有效的治疗性转基因产品的合理设计的可能性。对我来说，这就是未来!
我们今天面临的AAV衣壳的挑战，以及我在这里提到的其它挑战，最终将在结构生物信息学和数学算法的支持下得到解决。AAV结构生物信息学正在不断发展，以应对新的技术挑战，包括利用计算机技术的最新进展。NEO-AAV衣壳的创新即将到来，而这仅仅是AAV结构生物信息学驱动的革命的开始。
近两年来，在COVID-19大流行和疫苗竞争的压力下，核酸的非病毒递送方式得以全力重生，并将在基因治疗领域占据了长期地位。脂质纳米颗粒(LNP)平台作为一种非病毒递送系统，使基因疗法的临床转化非常快，许多人认为LNP可以解决所有核酸递送问题。然而，我们讨论的是两种不同的技术 - AAV和LNP - 它们的优势和局限性都不同。
与LNP不同，AAV衣壳可以进行多次和/或不同轮的细胞间/细胞内运输。相同的衣壳可以产生:1)-转胞吞作用（Transcytosis）和/或2)-内吞作用（Endocytosis），并以一种高度细胞类型特异性的方式，包括特定的细胞表面受体，成功地将治疗性DNA传递到细胞核。来自自然的rAAV“支架”已经进化出一系列适应性，使其更加高效和有效。以病毒为模板，我预计LNP将遵循与病毒载体进化非常相似的路径。
原文：L. Suarez, Innovationin rAAV gene therapy is a need: AAV capsids. Cell & Gene Therapy Insights. 2021; 7(12), 1647–1656.
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