强化填料技术，解决纯化挑战
本文节选自“Enhancing Resins Addresses Purification Concerns”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
强化填料技术可以提高层析纯化日益复杂的生物分子的能力。
随着生物制造商不断寻求改善产品分离和纯化的方法，下游层析填料正在不断增强。填料已被视为一种工具，可以满足新型COVID-19疫苗的纯化需求，以及日益复杂的生物治疗模式下游工艺中现有的挑战。
COVID-19带来了什么
Cytiva战略技术伙伴关系主管Henrik Ihre博士指出，COVID-19疫苗包括多种可能且不同的模式，如信使RNA (mRNA)、减毒病毒、病毒载体、蛋白质和病毒样颗粒。Ihre解释说，没有一种“唯一”的纯化方案可以适用于所有这些模式，因为每种模式的API在形状、大小和形式方面都非常不同。
“然而，高层次的需求是相似的。每种[方案]都需要实现高产纯化方案，以便在短时间内以高纯度的形式将疫苗推向市场，”Ihre解释说。“对于某些(但不是所有)模式，平台工艺和方案可能会被开发出来，从而缩短上市时间。特别是mRNA疫苗对市场来说仍然相当新，这就是为什么似乎没有这样的平台工艺。”
所有基于mRNA的API的一个共同特征是poly(A)尾，它由多个腺苷单磷酸组成。这些尾巴可逆地结合到可固定在固体载体上的多聚(T)配基上，这将使亲和类型的纯化成为可能。Ihre说:“这就是为什么oligo(dT)经常用于纯化基于mRNA的疫苗的原因。”
为应对COVID-19大流行而正在开发的一系列疫苗模式都依赖于不同的病毒或病毒部分作为其组成部分。虽然重组疫苗使用成熟的技术生产，被证明既安全又有效，但它们需要更长的时间来开发。然而，Avantor生物制药生产部门研发副总裁Nandu Deorkar证实，DNA或mRNA疫苗使用来自病毒基因组的信息来创建选择抗原的蓝图，这使得它们比传统疫苗生产得更快。
然而，基于mRNA的疫苗的关键纯化挑战是缺乏成熟的、具有成本效益的大规模工艺。目前有几种纯化技术正在使用，如沉淀、切向流过滤或层析分离。但是，当规模放大时，沉淀或体积排阻层析(SEC)并不划算。”Deorkar说。
亲和层析填料，如oligo(dT)，可作为捕获步骤，但这些填料不能分离单链RNA (ssRNA)和双链RNA (dsRNA)，而且它们的结合载量较低。Deorkar指出，可以使用疏水作用层析(HIC)和阴离子交换层析(AEX)，但需要仔细优化条件才能适用于大规模生产。Deorkar表示:“此外，这些HIC和AEX填料在作为捕获步骤使用时，容易形成污染，而且应该考虑填料的碱稳定性，如基于聚甲基丙烯酸酯的填料 (如Bakerbond Hipropyl或Bakerbond PolyQUAT)。”
现有的挑战
除了疫苗外，生物治疗的发展也看到了各种其它复杂模式的出现，如双特异性抗体和蛋白质片段，以及核酸碱基API。
Deorkar表示，总的来说，生物治疗产品模式固有的物理和化学复杂性增加了生产条件的多样性，提高了纯化工艺的难度。然而，在某些类别的生物药中，如单克隆抗体，有相似之处。“由于传统的单克隆免疫球蛋白G (IgG) 产品具有相似的结构和化学基序，平台纯化方法可以用于这类蛋白质的开发和生产。Protein A亲和层析提供了一种简单的捕获步骤，使克隆筛选更快，纯化工艺开发更简单，”他说。
Deorkar还解释说，质粒DNA (pDNA)和重组腺相关病毒(rAAV)是生物制药行业非常感兴趣的另外两类生物分子，但它们也面临许多纯化挑战。“例如，pDNA的大尺寸降低了AEX填料的载量，因为它不易进入孔隙。此外，关键杂质，如开环pDNA、基因组DNA和高分子量RNA具有类似的特性，使这些杂质的分离更加困难。”
Deorkar指出，rAAV纯化的一个主要挑战是去除空衣壳颗粒，这是上游工艺过程中产生的一种杂质。他说:“这些空衣壳不包含目的治疗基因，会引起患者不良的免疫反应。因此，在生产过程中，去除这些空衣壳颗粒是至关重要的。”
AEX填料依赖于空衣壳和完整衣壳颗粒之间的电荷差异，是最有效的分离方法；然而，由于该方法基于衣壳内包裹的DNA所导致的微小电荷差异，要求AEX填料具有更高的选择性。
“尽管每种产品模式的纯化挑战不同，但所有下游工艺都有一个共同的目标，即以经济有效的方式提高生产效率，同时确保最终产品达到纯度标准。层析通常是主流的纯化工艺，通过优化可以达到这些目标，”Deorkar说。
Ihre补充说:“对于任何下游工艺开发人员来说，关键的挑战是开发一个稳健、可放大、具有成本效益的工艺，以在更短的时间内将产品推向市场。”对于更成熟的治疗模式(如单克隆抗体)，几十年的工艺开发已经产生了或多或少“即插即用”的解决方案，而基于Protein A的层析是关键“赋能者”。
Ihre指出，对于更新、更复杂且缺乏独特结合区域的产品模式，通常需要开发新的方案，有时还需要开发新的填料，来满足下游的纯化目标。Ihre说:“开发一种全新的工艺 - 可能还是针对一种新API的新填料 - 是一个耗时的过程，这会推迟‘上市时间’。我们需要做出一些平衡选择，是使用现有的填料和工艺‘足够好’地解决下游纯化需求，还是开发新的、更量身定制的填料和工艺，以实现新的、效益更高的平台方案。”
针对填料所采取的行动
Ihre说，在过去的十年里，生物工艺的重点主要集中在工艺强化上，这意味着开发能够提高生产率、改善工艺经济性以及增加填料寿命的新填料。对于mAb的成功来说尤其如此。现在，我们开始看到一种基于各种新治疗模式的新格局，如病毒载体、mRNA、pDNA、细胞和基因治疗以及寡核苷酸，”他补充道。
Ihre指出，这些新模式的一个共同特征在于，它们在流体动力学粒径方面非常大。他说，如果分子不能进入填料内部的多孔结构，就会导致载量降低，这是经常发生的情况。Ihre认为，对于这样的目标分子，一个更开放的孔隙结构，如在基于纤维的装置中所看到的，可能允许结合载量和生产力的提高。Ihre说:“在质粒纯化工艺的研究中，与使用相同配基修饰的传统基球相比，基于纤维的装置的生产效率可以提高十倍以上。”
Deorkar说，与其它步骤相比，由于步骤的选择性、通用性、可放大性和成本效益，许多下游的解决方案可以在层析步骤中确定。pDNA的挑战在于其是大尺寸的分子，抑制了其扩散进入填料孔隙的能力，所以通过优化填料的孔径以提高pDNA的可进入性，可解决这一挑战，从而帮助实现更高的动态结合载量，并提高生产效率，Deorkar解释道。
Ihre说，如果目标分子能够进入填料的多孔结构，并与现有的配基结合，那么从“上市时间”和工艺经济性的角度来看，基于层析的传统工艺可能仍然是最好的替代方法。他指出，目前市场上有大量的填料可供选择，所有这些填料都与下游硬件纯化工艺兼容。
“这些填料提供了广泛的基球和孔径尺寸，以及配基类型和配基密度的选择；因此，开发一个稳健、可放大且高效的工艺的可能性非常大。然而，对于真的非常大的目标分子或具有挑战性的进样料液，其它纯化方法可能可提供更有竞争力的解决方案，”Ihre解释道。
纯化pDNA的另一个挑战是其固有的高度负电荷特性，这也是其它杂质(如RNA)所共有的，因此使用传统的阴离子交换填料很难分离这些污染物。在这种情况下，使用复合模式AEX填料(如Bakerbond PolyQUAT)可以提高相对于杂质的pDNA选择性。”Deorkar补充道。
Deorkar还指出，mRNA的纯化存在载量挑战，反相 (RP) 和AEX填料的动态结合载量极低。因此，需要大量的物料才能纯化出所需数量的体外转录产物。Deorkar表示:“具有更高结合载量的填料可以解决当前mRNA纯化过程中观察到的效率低下问题。”
层析是一种成熟的技术，具有良好的可重复性和可放大性，层析工艺中使用的填料为大多数生物分子的纯化提供了一种有效且高效的方法。Deorkar指出，与此同时，沉淀法、消解法、超滤或微滤法以及膜捕获都可以在实验室规模条件下有效地测试用于小规模样品。然而，由于工艺效率和可重复性，这些方法的放大可能是一个不小的挑战。
例如，纯化mRNA最常见的大规模工艺是亲和层析，然后使用离子交换(IEX)或反相层析(RP)。Deorkar表示，在实验室规模的工艺中，氯化锂沉淀法可能效果很好，但这种工艺的可放大性很差。亲和层析，如oligodT，通常用于捕获步骤，而dsRNA的去除可以通过RP或IEX填料步骤实现。“相反，在生产中，其它方法，如膜和整体柱，已经被研究过。尽管这些方法很有希望，但仍需要进一步的开发。”Deorkar说。
“传统上，对于所有生物制品，使用两到三个基于不同层析填料的多步骤方法能够纯化这些生物分子。与其它方法相比，填料在分离这些分子方面已经被证明是有效和高效的。”Deorkar补充道。
Ihre总结道：“通常，基于不同的纯化技术，可以达到相同的工艺目标，最佳实践可能取决哪些技术是已经商业化的，以及特定公司针对其它或类似工艺所采用的技术。”
未来应用
Deorkar说，层析填料将继续在生物分子的纯化中发挥重要作用；然而，为了更好地服务于该行业，特别是pDNA、RNA和病毒载体的纯化，还需要改进。他总结道:“随着上游工艺不断提高这些生物分子的滴度，改进现有的层析填料以增加动态结合载量，同时强化分离，以去除工艺相关杂质，将对这些生物疗法的生产至关重要。”
“层析填料由配基偶联至多孔基质而成。多孔基球的关键设计参数是结构材料、球和孔径，而配基的关键设计参数是配基的性质和固定在多孔基球上的配基密度，”Ihre解释说。他说，多孔基球的类型，由于其不同的构建材料、基球和孔径，在满足关键市场需求方面是相当先进的。新的基质设计可以被看作是针对某些应用领域进行优化的微调版本。
“未来，围绕新型填料创新的关键领域可能更倾向于配基设计方面。如果成本低廉的亲和配基和填料能够在短时间内开发用于新的分子，那么亲和层析很可能会获得更多的市场份额，因为它能够在一步之内获得高纯度和高收率。”Ihre说。他指出，另一个可能改变游戏规则的因素是，如果通用标签系统被开发并批准用于大规模的下游工艺，而不是像今天这样仅用于小规模或学术应用。
原文：F. Mirasol, “Enhancing Resins Addresses Purification Concerns,” BioPharm International 35 (1) 26–29 (2022).
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