mRNA治疗药物和疫苗的分析
本文节选自“Analysis of mRNA Therapeutics and Vaccines”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
分析方法必须跟上步伐，以确保不断发展的mRNA 候选产品的一致性、安全性和有效性。
针对 SARS-CoV-2 病毒的信使 RNA (mRNA) 疫苗的成功引起了人们对这个多年来稳步发展的领域的关注。对该领域的投资急剧增加，mRNA技术的许多应用正在通过临床前开发和临床试验而迅速推进。
与所有候选药物或疫苗一样，mRNA 产品必须满足国际协调会议 (ICH)、世界卫生组织(WHO)、FDA、欧洲药品管理局 (EMA) 和全球其它机构对分析表征的监管要求。
与大多数其它药物不同，mRNA 必须在专门的纳米颗粒中制剂，最常见的由脂质组成，以保护其免于降解并促进其穿过细胞膜。因此，需要进行额外的分析以确保纳米颗粒制剂以及mRNA 分子本身的质量和安全性。
mRNA 疗法早期开发阶段的一项关键工作是对mRNA 和纳米颗粒质量属性的广泛表征，因为众所周知，这些属性会强烈影响生物功效。鉴于药物开发的时间越来越短，获得更快、更高通量的分析方法变得至关重要。事实上，在mRNA 产品开发和质量控制 (QC) 测试期间使用的分析方法必须跟上步伐，以确保这些新的预防和治疗产品的特性、安全性和有效性。
广泛的分析需求
尽管 mRNA 候选产品的分析要求比传统生物制品的分析要求更复杂，但一些测试需求是相似的，而另一些则完全不同。SCIEX 生物制药行业质谱全球市场经理 Todd Stawicki 表示：“对蛋白质疗法和 mRNA 疗法进行充分表征是普遍的要求，以自信地鉴别和量化任何会影响其功效和安全性的质量属性。”他指出需要鉴别与工艺相关的杂质 - 在蛋白质治疗产品的情况下，是宿主细胞蛋白 (HCP)，而在 mRNA 的情况下，需要鉴别各种遗传杂质，如截短的转录本或不正确的DNA 模板。
然而，差异是显著的。mRNA产品的分析不像蛋白质治疗药物那样关注翻译后修饰，而是在药物开发的发现阶段重点关注mRNA、递送系统以及细胞摄取的表征，因为其与在给药后即可开始发挥功能的工程化蛋白质和单克隆抗体不同，mRNA递送给细胞后，会给细胞一个生产蛋白质的指令，而后者“真正”发挥作用，Agilent（安捷伦）解决方案开发科学家 Brian Liau 表示。
此外，mRNA 产品的生产需要独特的工艺步骤，例如体外转录 (IVT) 和脂质纳米颗粒制剂，这自然会产生不同的分析需求，Catalent 质量控制经理 Ryan Hanko 补充道。Waters（沃特世）生物制药高级业务发展经理 Joe Fredette 解释说，IVT 是一种化学过程，而不是基于细胞的过程。它还涉及使用一种称为RNA 聚合酶的酶，该酶将 DNA 转录为 mRNA。
作为不同分析需求的一个例子，Hanko 指出，mRNA 产品需要开发QC 检测来测量 IVT 步骤后可能存在的残留酶（如聚合酶或核酸内切酶），以确保它不存在于最终产品中。Intertek（天祥）业务发展总监 Ashleigh Wake 指出，RNA 序列的确认和 5' 端加帽效率以及3'端 poly(A) 尾分布的确定也是 mRNA 独有的。潜在的杂质谱也与其它分子完全不同，还需要可量化任何残留质粒或双链RNA 的方法。
此外，根据 Fredette 的说法，脂质分析工作流程对于 mRNA 产品的表征和化学、制造和控制 (CMC) 测试是必要的，包括液体纳米颗粒 (LNP) 成分分析，以确保配方中脂质的正确混合比、脂质身份确认和杂质分析及筛选。
Wake 总结说，从本质上讲，产品表征的总体要求有相似之处，其目的是评估或确认一致性、纯度/杂质、稳定性、活性等。“但是，”她强调，“要完全实现这一点，需要包括允许评估这些属性的mRNA 特异性分析。”
从早期到后期开发，演变的分析需求
基于蛋白质和 mRNA 的产品开发之间的另一个重要区别是早期发现阶段的分析负担。由于传统药物开发通常涉及mAb，Liau 博士说，生物分析要求往往相对“温和”，因为即使是非最佳的分子也可能用于证明靶标作用和治疗效果。相比之下，mRNA产物需要几个生物过程，包括细胞摄取、内体逃逸和蛋白质翻译，才能有效地发生，然后才能观察到任何效果。因此，mRNA和递送工具质量属性的分析表征从一开始就很重要。
“对于工艺放大和 GMP [良好生产规范] 生产/产品放行，mRNA 的化学表征仍然很重要。然而，重点往往转向确保制剂产品中一致的尺寸多分散性以及mRNA 封装，以及鉴定与工艺相关的杂质，”Liau博士评论道。
对于 mRNA 候选产品，Stawicki 补充说，酶促过程的放大需要对所有上游原材料 - 三磷酸核苷(NTP)、酶、加帽试剂、辅因子和多种脂质进行显著且困难的规模放大。“这些成分中的大多数都是大型、复杂的生物分子，它们自身具有相关的规模放大、纯化和分析挑战，”他解释道。
Hanko 表示，在生产过程中监控的属性也存在一些差异。A260 浓度检测和渗透压测试是早期开发和工艺规模放大阶段进行过程中观察的主要监测分析，而在GMP 生产期间，RNase 检测对于确保最终产品不会受到非产品材料的偶然污染的影响非常重要。
除了对安全和质量属性的典型药典评估外，核心放行检测还包括一致性确定、最终浓度、杂质含量（例如，残留蛋白质、dsRNA、rDNA）、加帽效率以及ploy(A)尾。
大量关键质量属性
为了满足有关评估 mRNA 治疗药物/疫苗产品的特性、功能和安全性的监管要求，必须监控大量关键质量属性(CQA)（见表 I）。“需要确认特定的mRNA 序列已经生成，mRNA 溶液处于目标 pH 值，并且任何潜在的工艺杂质（溶剂、蛋白质、DNA相关）都已得到控制，” Catalent 质量保证高级专家 Matthew Howard 说。
Howard 表示，还需要保证5'帽和 poly(A) 尾促进翻译、防止降解的特性足够。Wake 解释说，5' 端加帽的效率会影响靶蛋白的产生以及整体的免疫原性，而poly(A) 尾的长度/分布对于 mRNA 的翻译和整体保护至关重要。
表1. mRNA 治疗药物/疫苗产品必需监测的主要关键质量属性（CQA）
mRNA纯度 |
mRNA一致性/序列 |
% Ploy(A)尾RNA和长度 |
mRNA 5’ 加帽的效率 |
产品和工艺相关杂质 |
残留DNA模板 |
核酸内容物/数量 |
mRNA合成阶段、封装阶段以及最终包装的pH |
脂质成分一致性 |
脂质比例 |
脂质杂质 |
Catalent 质量控制高级科学家Maxwell Meller 补充道：“mRNA 分子的 5' 端加帽对其在递送至靶位点后的完整性至关重要，与其它类型的药物相比，这是mRNA 生产的独特要求。然而，加帽材料的表征和监测已被证明需要消耗大量的时间和资源。”
Fredette 表示，对于脂质成分，确认LNP 混合物中每种脂质的特性以及它们以正确的比例存在是必不可少的，因为这些CQA 可以直接影响 LNP 的形成和功效。他强调，确保脂质杂质得到良好控制并低于临界阈值也很重要，因为脂质和mRNA 杂质都会对工艺结果产生不利影响，在某些情况下会降低mRNA 的效力。
对无 RNase 区的需求
在使用基于 mRNA 的疗法和疫苗时，mRNA 对酶（尤其是RNase）降解的敏感性产生了额外的独特要求。例如，Hanko观察到使用消除RNase的制备方法至关重要，除了人员培训和关于维护无 RNase 区、设备和个人防护设备 (PPE) 的意识外，实验室还应考虑物理空间隔离。
Hanko 说，这些行动很重要，因为受损的mRNA 样品在这些分析中会显示出低于预期的纯度。一些分析，如残留杂质分析，可以说不受受损mRNA 的影响，而其它分析可能只需要提高RNase 灵敏度，具体取决于溶液制备和材料操作。“即便如此，”Hanko 说，“无论所需的缓解程度如何，都必须了解所有方法的核心方法性能预期。”
时间往往是敌人
mRNA 分析面临的最大问题之一是生物制药行业的全面发展。“这里最大的敌人是时间，”Stawicki 断言。“不幸的现实是，当前的许多功能和生物物理测试仍然太慢，无法在能够干预过程的时间范围内产生可操作的答案，”他解释道。
例如，Stawicki 强调了基于细胞的功能分析，这是当今的黄金标准。“这个测试是最好的早期指示，表明你已经做对了，”他说。“您将配制的mRNA LNP 给药于细胞，看看您是否获得了足够产量的正确蛋白质或抗原。问题是可能需要几天时间才能读出结果。因此，开发人员常常不得不在没有分析数据支持其工艺参数的情况下，在他们的工艺开发中冒着风险行进。”
在早期开发过程中使用多种互补技术
mRNA 产物的生物分析需要结合熟悉的以及更新颖的分析技术和方法。Hanko 重申，它还需要控制和消除可能损害产品完整性的RNase 酶。
需要采用多种分析技术来评估这些特性。Stawicki感兴趣的是他们来自不同的背景。高效液相色谱(HPLC) 和质谱 (MS) 已从蛋白质治疗药物表征中迁移出来。电泳技术（最著名的是毛细管电泳）来自经典的分子生物学应用。粒度测定技术来自聚合物分析或材料实验室。
“由于 mRNA 疗法是如此庞大的异质复合物，它实际上归结为候选产品的哪一部分需要表征，”Stawicki 评论道。对于 mRNA 成分，他指出毛细管电泳甚至平板凝胶电泳方法是首选方法。对于脂质和LNP 的表征，带电气溶胶检测 (CAD) 的 HPLC 或LC-MS 通常是首选方法。对于完整的 mRNA-LNP 复合物，首选粒径或冷冻电子显微镜等技术。
Liau 博士说，早期开发过程中的一些常见活动是mRNA 密码子优化和最佳 5' 和 3' 非翻译区(UTR) 的选择。由于这需要从文库中克隆编码序列并将它们组合到具有不同UTR 的多个质粒中，因此 Sanger 测序、毛细管或平板凝胶电泳和聚合酶链式反应 (PCR) 仍然是这一阶段的主要分析方法。
根据 Fredette 的说法，药物 mRNA 成分的表征和CMC 测试包括一系列核酸 (DNA/RNA) 分析工作流程，以确认 mRNA 的一致性和纯度，包括5' 帽分析、Poly(A) 尾分析、寡核苷酸图谱（类似于肽图谱，但用于核酸）以及基于 MS 的测序。
同时，MS 还用于建立关键质量属性，例如加帽效率和 poly(A) 尾分布，Wake 指出。她补充说，所有这些分析都是在更传统的QC 要求之外进行的，例如分析 [紫外 (UV)/HPLC)] 分析、残留溶剂、金属等。
为了确认候选 mRNA 的生物活性，使用阳离子或可电离脂质的、经过充分研究的脂质递送系统可用于体外转染标准细胞系。“对于这样的早期实验，”Liau 观察到，“通常不需要使用高度纯化的 mRNA 或脂质纳米颗粒的单分散制剂。相反，动态光散射和zeta 电位测量通常用于确保纳米颗粒具有大致正确的尺寸和表面电荷特性，以实现有效的细胞转染。然后可以通过荧光显微镜、酶测定或适当的免疫染色来确定生物活性。”
在后期开发过程中寻找更简单、更稳健的解决方案
从开发早期到 GMP 环境，通常使用类似的分析技术。Fredette 观察到，例如，LC 和LC-MS 工作流程在开发的所有阶段和生产过程的监测中极具价值。
然而，由于工艺优化和放大的目标通常与早期开发研究的目标大不相同，Liau评论说，在某些情况下需要不同的分析技术。“在工艺优化和放大过程中，mRNA 序列是固定的，其生物活性是已知的，重点是监测和/或提高工艺产量及 mRNA 质量属性，”他说。
Liau 补充说，LC-MS对于监测体外转录反应的进程以及确定关键质量属性的状态（如5' 加帽）都非常有用。同时，基于分离的技术，如尺寸排阻色谱-多角度光散射 (SEC-MALS) 和场流分级(FFF)-MALS，可能有助于监测 LNP 的性质以及优化复合过程。
Stawicki 指出的一个重要趋势也出现在蛋白质疗法中，Meller同意称，随着管线项目的深入，人们更倾向于使用越来越稳健且更简单的技术。例如，他指出，虽然 LC-MS 是表征和定量加帽物种的有前途的工具，但更简单的方法更适合日常使用。“在 QC 环境中，”Meller说，“色谱分析必须凝练为 HPLC 分析，以优先考虑速度和高效的数据分析。”
总的来说，Wake 认为，与用于其它药物模式的方法相比，许多用于完全理解 mRNA 的方法在 QC 领域是新颖的。“为了完全支持所有监管要求，有必要更多地使用下一代测序等技术，这些技术在 GMP 环境中并不是典型的技术，”她解释说。
然而，对于加帽等其它考虑因素，Wake 表示所使用的技术更为熟悉，并且往往大量基于 MS。不过，即使在这些情况下，她也指出整体样品制备方法通常是新颖且具有挑战性的。“考虑到最佳科学、质量数据和法规遵从性，我们和其它实验室正在开展大量工作来开发平台方法，以克服这些挑战，”她总结道。
重大创新正在进行中
事实上，人们在推进 mRNA 疫苗和治疗药物的分析方面付出了巨大的努力。“几十年来，科学家们一直在研究 mRNA，但其中很多工作都集中在优化分析方法以实现生产级技术。随着基因疗法的爆炸式增长以及现在对mRNA 的浓厚兴趣，您会看到科学家和仪器公司进行了大量投资和创新，以开发最佳分析解决方案来支持这项工作，”Stawicki争辩道。
例如，SCIEX 在 ZenoTOF 7600 中引入了电子激活解离(EAD) 作为一种新的 MS 碎片化技术。根据 Stawicki 的说法，该公司最初推出时考虑了小分子和蛋白质疗法，后来了解到EAD 技术是也可用于分析 mRNA 产物。“EAD 在寡核苷酸和LNP 表征方面具有惊人的用途，例如，允许在单个实验中对脂质进行灵敏和完整的结构表征，包括双键位置和异构体构型。”
Stawicki 还提到了SCIEX 的新型 BioPhase8800 多毛细管 CE 仪器，该仪器最多可以同时对相同或不同的样品进行八次分析。“我们正在探索如何将 BioPhase 的高通量能力用于各种不同的 mRNA 应用，”他说。
据 Liau 介绍，安捷伦最近开发了一种改进的方法，用于通过 LC-MS 快速分析 mRNA 5' 加帽。该分析需要酶促切割，因为mRNA 是一个大分子。已建立的方法需要两个极具挑战性的样品制备步骤：使用生物素化寡核苷酸探针进行亲和捕获，以及使用RNase-H 对亲和捕获的 mRNA 进行定点切割。
由于亲和纯化效率低下，该方法无法可靠地处理某些mRNA 序列，因此安捷伦开发了一种改进的样品制备方法，包括在溶液中进行定点切割，无需亲和捕获，然后使用硅柱纯化切割的寡核苷酸和mRNA 样品基质。使用热稳定版本的 RNase-H 酶也可以减少样品制备时间。
整个过程（样品制备、分析和数据处理）仅需75 分钟，无需进一步的样品纯化即可将目标寡核苷酸从mRNA 样品基质中分离出来。“当与专门设计的冲洗方案结合使用以减少样品基质在色谱柱上的堆积时，这种方法产生了出色的线性、灵敏度和重现性，”Liau说。
Howard 强调了目前正在改进的几种有前途的技术，用于评估细胞中的蛋白质表达，例如用于检测细胞内dsRNA 水平的流式细胞术以及针对表达蛋白质的抗原特异性荧光检测，这两种技术都为细胞摄取、RNA扩增以及蛋白质生产提供了快速的结果。“这种直接测量可以减少体内抗原研究的周转时间。新技术当然看起来很有前景，并且可能在未来几年内变得更为实用，”他相信。
Wake 在重新关注NGS 技术；尽管它一般来说并不新鲜，但它在GMP 环境中的使用是新的，对于 mRNA 产品，NGS 的引入对于实现所需的质量控制至关重要。同样，她说电子显微镜是一项必不可少的技术，以及建立体外溶出性能的方法，用于评估封装的产品。然而，这样做需要对主要与美国药典 4型溶出度测试相关的方法进行调整。
Wake 也重申了开发平台分析技术的重要性。她说，平台方法的持续改进适用于确定mRNA 是否真正在适当的内部脂质体 pH 值下封装在纳米颗粒系统中，以支持早期产品，而不需要广泛的开发，这是一个有希望的例子。随着产品进入后期阶段，这些相同的方法会被优化并最终针对每个特定产品进行验证。“但是，”Wake 认为，“在开发周期中尽早了解这些关键方面需要一种通用方法。”
mRNA 分析仍处于早期阶段
重要的是要记住，mRNA 技术本身正在迅速发展并不断演变。因此，mRNA 治疗药物和疫苗的分析方法开发人员不仅面临这些生物分子及其递送载体的复杂性的挑战，而且还需要开发灵活的方法来适应mRNA 结构和最终制剂的持续变化。
例如，Wake 指出，虽然迄今为止的 mRNA 产品主要被开发为注射剂，但吸入和鼻腔给药提供了可行的替代方案。“这些给药途径不仅有助于提高生物利用度，而且即使在没有必要的医疗保健管理系统的情况下，产品也可以以不那么困难的方式给药，”她解释道。
Fredette 建议，科学家们应该考虑随着他们的成长，他们需要在组织中部署分析平台和工作流程，以及确认如何最好地协调一切，从方法开发和方法/数据转移；确保数据的完整性、可追溯性和合规性；达到他们想要和需要的服务和支持水平。
“我不认为我们已经开始接近 mRNA 治疗分析的稳定状态，”Stawicki 说。“自从 Moderna 的elasomeran (Spikevax) 和Pfizer-BioNTech的 tozinameran(Comirnaty) 成为改变世界的疫苗，我们认为mRNA技术将继续快速发展。许多公司现在正在开发 mRNA 的“变体”，例如自扩增 mRNA 和环状mRNA。此外，科学家们正在开发新型载体和靶向mRNA 疗法的策略。所以，是的，我们仍处于这场技术革命的开始阶段，”他总结道。
原文：C. Challener, “Analysis of mRNA Therapeutics and Vaccines,” BioPharm International 35 (2)(2022).
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