基于拉曼光谱监测高密度细胞灌流培养中的氨基酸和抗体N-糖基化
基于拉曼光谱的预测模型提供了一种过程分析技术(PAT) 工具，可用于监测和控制生物过程中的培养参数。稳态灌流培养产生相对稳定的代谢物谱，由于培养参数没有变化，因此不利于建模。在这里，我们提出了一种方法，通过在工艺开发过程中细胞密度高达100 × 10^6 cells/mL 时细胞特异性灌流速率(CSPR) 在 10 - 40 pL/（cell * day）之间的变化获得不同的稳态，后者提供了一个动态培养环境，有利于模型校准。在相似的CSPR 下，细胞密度对培养性能没有影响，但CSPR 的变化对代谢、mAb 生产力和 N-糖基化有很大影响。研究针对多种培养参数开发了预测模型，包括细胞密度、乳酸、氨和氨基酸；然后通过在多个或单个稳态下执行的新运行进行验证，显示出很高的预测准确性。对氨基酸和抗体N-糖基化的关系进行了建模，以实时预测产品的糖基化模式。与拉曼光谱集成的有效工艺开发方法为以后在稳态灌流生产工艺中的实施提供了有价值的PAT 工具。
复杂治疗性蛋白质的生产主要以哺乳动物细胞培养工艺进行。用于生产生物药，尤其是单克隆抗体(mAb)，的最常用的哺乳动物宿主是中国仓鼠卵巢(CHO) 细胞。补料分批培养是使用 CHO 表达平台生产 mAb 的首选工艺模式。然而，连续工艺技术在过去几年中在该行业中获得了相当大的关注。这种从批次操作到连续操作的缓慢转变是生产力提高、以及资本和运营成本随之降低的结果。此外，连续灌流生物反应器的稳态操作可以使收获液中的产品质量保持一致，并提供了通过工艺参数的不同变化来调节产品质量属性的可能性。
为了灌流工艺的稳定运行，过程监测和控制策略是相关的。灌流中的一个常见监测工具是使用电容探针进行在线细胞密度监测，通过调节细胞废弃率而进行反馈控制。[相关阅读：基于电容探针-CSPR控制的N-1灌流平台开发]。FDA的行业指南鼓励药品制造商使用先进的过程分析仪器和多变量方法进行持续的实时控制和质量保证。
在线拉曼光谱与多变量技术相结合是一种强大的过程分析技术(PAT) 工具，可实现质量源于设计 (QbD)。拉曼光谱已被证明可用于实时监测补料分批工艺中的重要细胞培养参数，例如葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、氨、细胞密度、渗透压、pH和产物滴度。已有研究开发了偏最小二乘(PLS) 回归模型，以将光谱信息与参考分析测量值相关联。此外，可以为这些细胞培养参数中的一些开发与细胞系无关的通用模型，这最终将促进基于拉曼的PLS 模型在工业中的应用，而无需针对新细胞系进行模型重新校准。机器学习方法可用于校准通用模型。不是全局模型，而是从全局数据集的相关数据点子集为每次拉曼扫描实时构建单独的局部模型。因此，通过模型适应频繁的过程变化和干扰，可以实现更大的稳健性，同时保持准确性。
拉曼光谱已被提议用于监测产品质量。一项研究表明，PLS模型可以区分糖基化和非糖基化 mAb。最近还报道了在双特异性抗体的灌流培养中检测高分子量物质和甘露糖-5 聚糖。众所周知，操作参数如 pH 、温度、溶氧浓度、加糖策略等会影响目标产物的糖基化模式。在CHO 细胞中生产的 mAb 的 N-聚糖由相似的结构组成，仅在少数糖残基上有所不同，但是它们的存在或不存在会显著影响mAb 的药代动力学和药效学。大多数 mAb N-聚糖属于“复合”类型：N-乙酰氨基葡萄糖和甘露糖主链，半乳糖基化程度可变，例如G0、G1 和G2，其中数字代表半乳糖残基的数量。另一种常见的修饰是核心上的岩藻糖基化，例如G0F（岩藻糖基化聚糖）vs. G0（非岩藻糖基化聚糖）。使用PAT 工具来监测生物反应器中的这种产物质量属性以及随后通过收获液连续放行产物将是一项非常有价值的技术。
虽然在补料分批工艺中证实了许多有用的应用示例，但缺乏专注于灌流培养的文章。最近报道了细胞密度50 × 10^6 cells/mL 的灌流培养的在线监测和控制。与批次或补料分批操作相比，灌流培养的稳态操作在营养和代谢物浓度的变化方面可使培养环境的动态性降低。这对于多变量模型的校准可能不是最理想的，因为产生稳健预测模型所需的光谱差异性不够大。
在本研究中，我们开发了一种策略，通过在灌流工艺开发过程中实现稳态变化，用拉曼光谱校准培养成分的预测模型。工艺开发系统地探索了改变细胞密度和灌流速率对不同细胞特异性灌流速率(CSPR) 值的影响，即代表各种稳态方案。活细胞密度、乳酸、氨和16 种蛋白质氨基酸浓度通过拉曼光谱使用化学计量建模方法进行预测。该模型预测不同稳态参数的能力通过独立灌流运行的数据集进行了验证。此外，根据观察到的氨基酸浓度和糖基化之间的高度相关性，使用这些代谢物校准了mAb N-糖基化（包括 G0、G1、G0F、G1F 和G2F 糖型）的 PLS 回归模型。然后使用离线测量或通过拉曼光谱获得的在线代谢物预测，使用未用于模型训练的培养数据对其进行验证。
详细的细胞培养实验、离线分析、拉曼光谱、基于拉曼的多参数模型操作，请参考原文。
灌流培养
在这项研究中，我们旨在开发一种灌流工艺并同时校准预测性拉曼光谱模型，以实时监测多个相关的细胞培养参数。理想情况下，为了通过拉曼探针为代谢物检测提供校准测量，应建立动态培养环境，其中校准样品跨越过程中使用的整个值范围。为了生成训练数据集，这里假设通过应用细胞特异性灌流速率(CSPR) 的受控变化，可获得针对稳态灌流培养中活细胞密度、乳酸、氨和氨基酸浓度的拉曼光谱模型。
CSPR 由两个自变量灌流速率 D和细胞密度 VCD 确定。通常，为了提高产物滴度并减少培养基消耗和收获需求，CSPR 会被尽可能降低。确定CSPRmin 的常用方法是“push-to-low”优化，其中，CSPR 逐步降低到产生足够生产力、培养稳定性（活性）以及良好产物质量的水平。这可以通过两种不同的途径来实现：维持恒定的VCD 并降低灌流速率或维持恒定的灌流速率并增加VCD。
研究使用平行小规模灌流生物反应器比较了这两种策略：在运行#a和#b 中，VCD 恒定为约100×10^6 cells/mL，在运行#c中，灌流速率恒定为 1 RV/day（图 1A-B）。CSPR 分 3 步从 40 降低到10 pL/（cell*day）：从40到 25、从25到15再从 15到10 pL/（cell*day）。注意，在运行#c 中，由于目标 VCD 较低（25×10^6 cells/mL），所以比运行#a-b 更早达到了 40pL/（cell*day）的第一个稳态。在整个实验过程中，细胞的活性保持在96% 以上。结果表明，通过 CSPR 的逐步变化，实现了在代谢物浓度（图 1C-D）和 mAb 滴度（图1E-F）方面具有不同响应的不同稳态。
图1. (A) 活细胞密度和活性，(B) 灌流速率，(C)生物反应器中的乳酸浓度，(D) 生物反应器中的氨浓度，(E) 生物反应器中的mAb 滴度，(F) 收获液中的 mAb 滴度，灌流培养#a（红色菱形）、#b（黄色三角形）、#c（绿色方块）和#d（蓝色圆圈）。
实验结果表明，“push-to-low”优化可以通过两种不同途径来实现相同的结果，要么保持 VCD 不变，要么改变灌流速率。在任何一种情况下，在相同的 CSPR 下都实现了等效的稳态。将 CSPR 从40 变为 10 pL/（cell*day）导致了高度动态的培养环境。基于拉曼的模型的校准需要一个动态数据集，在批次或补料分批工艺中，其固有动态会自然提供，而稳态灌流模式则没有。除了生物反应器中的初始细胞扩增阶段外，在具有恒定CSPR 的长期稳态培养中，在当前数据集中观察到的变化是不可能的。因此，我们在这里提出了一种策略，通过操作动态灌流培养来促进拉曼模型的开发，例如通过“push-to-low”优化。在这些类型的工艺优化运行中收集拉曼光谱以进行后续模型校准，有关生产力、细胞生长、细胞活性和产品质量的数据收集用于设计新的灌流工艺。
以 15 pL/(cell*day) 的CSPR 进行更能代表生产运行的长期稳态培养（运行#d）。在运行#d 中，通过增加灌流培养基中的Cb7a 补料浓度，对培养基配方进行了优化，以在较低的灌流速率下恢复mAb 细胞的特异性生产力。因此，mAb 生产力增加（图 S1A）。培养数据如图1A-F 所示。为了研究溢出代谢增加的影响，在第16 天将目标葡萄糖浓度从 1 增加到 1.4 pmol/（cell*day），导致乳酸浓度升高到 27.5 mM（图 1C）。细胞特异性 mAb 生产力保持不变，但在较高的乳酸产量下生长速率降低（图 S1）。有趣的是，这导致 mAb 单位体积生产力的进一步提高，因为细胞废弃率在较慢的细胞生长时降低。
关于 mAb 的 N-糖基化，当降低CSPR 时，检测到具有一个或两个末端半乳糖残基（G1F和 G2F）的糖型比没有末端半乳糖（G0 和G0F）的糖型更高百分比的趋势。然而，当应用相同的CSPR 时，N-糖基化模式在高细胞密度和低细胞密度下的稳态中相当相似。不同的机制被提出为影响糖基化的因素，包括糖基化酶的活性，以及高尔基体中核苷酸糖的可用性和细胞外营养物质的摄取率。Hutter等将细胞特异性生产力和氨浓度与以灌流模式培养的CHO细胞的半乳糖基化活性联系起来。较高的氨浓度和 mAb 生产力可能会导致特定的半乳糖基转移酶活性降低。在我们的培养物中观察到类似的相关性，其中较高的CSPR 导致氨浓度和 mAb 生产力增加，以及半乳糖基化聚糖的减少。氨和 mAb 生产力的变化是由养分吸收和可用性的变化介导的。
其它部分详细结果和分析，请参考原文。
图 2. 运行 #a 和#b 的校准数据集中 PLS 模型参数的测量浓度（y 轴）与预测浓度（x 轴）。
图3. 灌流培养#c中参数的时间进程预测。在运行期间获得了919 个光谱数据点。(A) PLS1 模型对 VCD、乳酸、氨和甘氨酸的实时预测。相应的离线测量用圆圈表示。(B) PLS2 模型的氨基酸浓度预测与参考测量值。
图5. 糖型的 PLS 回归模型。(A) 前两个潜变量的得分图。(B) 第一个潜变量的系数图。(C) 测量的离线百分比(y 轴) 与预测的糖型百分比 (x 轴)。
图6. mAb 糖基化模式（G0、G0F、G1、G1F、G2F）的时程预测。(A) 验证运行#c中的预测。预测来自 919 个氨基酸的实时测量。(B) 验证运行#d中的预测。通过 HPLC 分析进行氨基酸测量以预测糖基化模式。UPLC分析中的参考糖基化测量值在两个图中均以圆圈显示。
总结
研究开发了支持 100×10^6 cells/mL 且 CSPR 低至 10–15 pL/(cell*day) 的灌流工艺。从在多个稳态下运行的灌流培养得出的结论是，在恒定的CSPR 下，细胞密度本身对包括 N-糖基化在内的培养性能没有影响。然而，从细胞密度和/或灌流速率的变化中获得的不同 CSPR 对代谢、mAb 生产力和产品质量具有强烈的影响。葡萄糖定向补液（TAFE）的应用，允许严格控制乳酸的产生以及对培养基深度的葡萄糖非依赖性探索。这也说明了TAFE 方法的优势，可在工艺开发过程中用于确定糖的补液。
研究还开发了 PLS 回归模型，以同时预测 CHO 细胞灌流培养中的多种培养参数（VCD、乳酸、氨和氨基酸的浓度，以及 mAb 的 N-糖基化）。如代谢物浓度曲线所示，灌流开发运行中的稳态变化引发了培养环境的变化。由于在工艺开发过程中产生的数据中的成分和光谱差异性，我们能够将许多代谢物的浓度与获得的拉曼光谱相关联。通过独立的灌流培养验证了模型的预测能力。由于多稳态实验设置与适当的光谱处理技术相结合，我们能够证明拉曼光谱估计的参数具有非常好的预测性能。与总体低RMSEP 的离线分析检测相比，验证运行中的稳态变化得到了准确预测。VCD、乳酸和氨的预测也针对单一稳态操作的灌流培养进行了比较。令人惊讶的是，尽管在我们的数据集中不存在在批次或补料分批操作中获得的动态，但拉曼实现了非常好的预测。重要的是要指出，在这里研究的每种灌流条件下，都收集了几个类似的采样事件，具有良好的统计重现性。当VCD 在运行#c 中以恒定灌流速率变化时也是如此，因为 CSPR 保持在选定的水平。换句话说，目前的 PLS 模型校准是使用一系列明确定义的条件生成的，每个条件都有几个相似的数据点，与在培养每天都在变化的补料分批或批次模式中生成的数据相比，代表了潜在的更好的质量信息来识别模型。
将拉曼光谱与多变量数据分析结合使用可被视为在灌流工艺中实现PAT的重要技术。PAT 在这些工艺中非常重要，因为这些工艺需要在数周内保持培养特性。代谢物浓度和产品质量属性的实时测量的可用性与灌流特别相关，因为目的产物是从培养中不断收获的。尽管在某些情况下，在线和离线检测之间存在15-20% 的较大差异，但与其它更繁琐的分析方法相比，由于检测的快速性以及探针用于生物反应器的便利性，该技术是实时监测代谢物和聚糖趋势的良好工具。基于当前发现的进一步工作将可以帮助实现基于拉曼检测的高级反馈控制策略，以确保目的产物的质量。在早期工艺开发中，拉曼光谱在小规模平行生物反应器中的应用，如本文所用，可以促进后期工艺开发和生产模型的可用性。在这里，实验的设计使拉曼光谱的有效工艺开发和PLS 模型成为可能。
在细胞培养过程中通过拉曼光谱监测产品质量属性的文献仍然很少。在这项工作中，我们提出了通过输入离线分析代谢物检测或来自需要拉曼光谱的PLS 模型的在线预测来监测 mAb 的 N-糖基化模式，包括G0、G0F、G1、G1F 和G2。该方法的可行性由来自三个灌流运行的有限数据集证明，其旨在生成用于模型校准的动态数据集。
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原文：H.Schwarz, M.E.Makinen, A.Castan, et al., Monitoring of amino acids and antibodyN-glycosylation in high cell density perfusion culture based on Raman spectroscopy. Biochemical Engineering Journal, 2022, 182:108426.
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