赋能蛋白质表征
本文节选自“Empowering Protein Characterization”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
科学家们可以通过赋能技术来克服与蛋白质表征相关的挑战。
蛋白质治疗药物是用于治疗多种疾病的一类重要药物。根据市场研究，蛋白质治疗药物市场预计在2020 年至 2027 年间以 6.86% 的复合年增长率增长。预计这一增长将受到慢性疾病、技术进步、蛋白质疗法意识的扩大、越来越多地采用血浆衍生疗法来治疗慢性疾病以及政府采取措施发展医疗健康行业的推动。
然而，众所周知，治疗性蛋白质的稳定性不如传统药物，并且由于其复杂的分子结构，它们可能难以成功开发。“与小分子和多肽相比，蛋白质要复杂得多，”Element Biologics 高级总监 Khanh Courtney 博士解释说。“因此，了解蛋白质生物分子的生物物理和生化特性对于确定关键质量属性 (CQA) 以确保一致的安全性和有效性至关重要。”
Courtney指出，由于蛋白质是由相互作用的长链氨基酸形成的，形成了二级和三级分子结构。她说，除了三级结构之外，蛋白质还可以与自身结合，从而形成更高阶的结构，例如二聚体、三聚体和寡聚体。
“某些氨基酸可以用磷酸基、甲基、单糖或复合糖等进行翻译后修饰，从而形成一种高度复杂的蛋白质治疗性分子，”Courtney说。“蛋白质的折叠、更高级的结构及其翻译后修饰的组成，特别是聚糖，都是可能影响分子效力和功能的蛋白质表征的例子。”
最高重要性
Agilent Technologies生物制药战略项目办公室负责人 Martin Vollmer 强调说：“蛋白质表征在价值链从发现到开发再到质量控制的所有阶段都具有最高的重要性。蛋白质的表征提供了与其功能直接相关的结构和组成信息，有助于更好地了解差异并确保开发的生物制药产品的质量标准符合监管指南，确保药物疗效和药物安全性。”
对于Waters Corporation生物制药市场高级经理 Scott J. Berger 博士来说，无论是通过重组还是合成工艺制造蛋白质药物，开发都应该从蛋白质表征开始，并尽可能多地了解产品。“有些工艺是不完美的，因此它们将制造具有低水平的产品，这些产品会受到降解途径的影响，从而进一步提高产品的可变性，”他指出。“正是这种复杂性导致了对复杂分析工具的依赖。”
Berger 补充说，液相色谱(LC) 和质谱 (MS) 等工具为工艺科学家提供了监测分子重要属性以响应工艺变化的能力。“这种能力使科学家能够灵活地逐步优化他们的工艺，通过建立分析可比性来提高药物质量和产量，”他说。“表征分析通常转化为用于过程监控和产品放行的有针对性的方法，您可以在其中验证您是否可以控制您的工艺和产品质量。”
多项挑战
Courtney 强调，与蛋白质表征相关的一个关键挑战是方法通常需要大量测试材料。“理想情况下，蛋白质表征是在化学、制造和控制 (CMC) 程序开发的早期阶段完成的，以便及早识别关键属性。不幸的是，CMC 的早期阶段，例如在工艺开发期间，包括在实验室工作台上完成的小规模生产，产量很低，”她说。“这一挑战可以并且正在通过分析方法的进步来应对，这些方法可以在单个样品制备或方法中一次评估多个特征。”
使用高分辨率、高灵敏度 MS 可以找到如何克服这一挑战的一个例子。“这种方法可用于破译蛋白质的肽图、翻译后修饰、脱酰胺、二硫键、聚集、分子量验证、聚糖结构解析，甚至三级结构测定，所有这些都在一种方法中，”Courtney解释说。“通过将多种属性打包到一种方法中，在实验室工作台生产的少量蛋白质可以产生大量数据，以用于评估蛋白质特性，从而更好地为制造和质量决策提供信息。”
在 Berger 看来，蛋白质表征面临着几个直接的挑战。“首先，分子越来越复杂，”他说。“我们看到了双特异性和三特异性分子、抗体偶联药物[ADC] 和复杂融合蛋白的出现，所有这些都比典型的单克隆抗体具有更多的属性可变性，需要增强分析来定义和监控它们。”
此外，鉴于监管机构越来越多的加速审查，挑战已经出现，即能够在压缩的时间维度内充分表征分子，同时进行稳定性研究和制剂开发，Berger指出。“因此，越来越需要能够利用先验知识加速这些研究的高效分析平台方法，”他说。
“许多组织面临的另一个挑战是在产品发现/开发的克隆筛选阶段缺乏可操作的知识，”Berger 继续说道。“在这个阶段使用LC-MS 可以确保生物仿制药在一系列重要和关键质量属性方面与创新分子的目标分析特征相匹配。”他指出，当用作质量源于设计 (QbD) 方法的一部分时，LC-MS可以帮助确保将所需的产品属性构建到分子中。Berger警告说，如果在这个开发阶段对分子的了解不足，那么在产品投入临床生产之前，可能不会发现杂质或不稳定性。
Berger 强调，对于实验室科学家来说，实验偏差可能是一项重大挑战。“不同科学家的分析测试结果不同的一个主要原因与复杂且多步骤的样品制备方法有关，”他说。“对于通过LC-MS 对生物分子进行多属性监测，获得高质量且可重复的样品，以获得有意义的结果非常重要。为了满足这一需求，许多团体正在研究自动化样品制备技术，将其作为一种工具，通过消除潜在偏差分析结果中的人为因素，来提高样品质量和重现性。”
Berger 指出，在分析有机酸、有机磷酸盐、寡核苷酸、磷酸肽、酸性聚糖和磷脂时，不希望出现的二次相互作用会对分析数据产生不利影响。“二次相互作用的一个例子是某些生物分子对液相色谱仪和色谱柱的金属表面甚至钛等生物相容性材料的非特异性吸附，”他说。“另一种类型的二次相互作用是由蛋白质的高活性表面引起的，其倾向于与UHPLC或 UPLC色谱柱中二氧化硅和杂化二氧化硅色谱颗粒上的疏水和静电活性位点相互作用。”
Waters首席生物分离产品经理Bill Warren 称，这些二次相互作用在通过体积排阻色谱法(SEC) 表征和监测药物产品时会造成困难，后者用于确定蛋白质样品粒径异构体。Warren指出，如果不仔细控制这些属性，那么产品的安全性和有效性可能会受到不利影响。“正是出于这个原因，监管机构要求制药公司准确量化蛋白质药物产品中的蛋白质粒径异构体，如mAb 聚体、单体和片段，”他说。
Vollmer 强调蛋白质表征非常复杂，并且随着时间的推移只会变得更加复杂。“过去，主要是单克隆抗体（mAb）、激素、疫苗、修饰过的人蛋白质，以及类似的治疗性蛋白质。现在随着抗体偶联药物(ADC)、融合蛋白、双特异性抗体和其它模式的发现，蛋白质表征任务现在需要一种更加灵活的方法，”他断言。
这种日益增加的复杂性也与需要进行表征的分析科学家的技能有关，Vollmer强调说。“需要进行大量分析，所需的仪器更复杂，但成本更高，”他解释道。“因此，最大的障碍是实施、运营和技术人员的成本。”
“另一个重要挑战是需要分析大量数据以获取有意义的信息和进一步的行动，”Vollmer继续说道。“更广泛地说，行业的监管障碍和惰性往往是快速创新的障碍。”
赋能技术
“LC 和 MS 一直是针对表征明确的生物治疗药物的赋能技术，”Warren说。“LC 对于全面分析完整蛋白质或其亚基、以进行聚糖谱分析或肽图谱分析或查看蛋白质电荷或粒径异构体至关重要。”
Warren 补充说，一种可用于表征蛋白质粒径异构体的技术是SEC。他说，最近有几种新的 SEC 色谱柱推向市场，这些色谱柱解决了“在分离分子量范围为10,000 至 10,000 至6,500,000 道尔顿的蛋白质聚体、单体和片段时的二级相互作用（包括离子和疏水）问题。”
Berger 还指出，通过结合LC 和 MS，可以建立一级结构（产品序列），这是监管文件提交的要求。“使用 LC-MS，您可以探索产品变异性、稳定性和降解途径，监控哪些‘热点’以确保产品质量和您的工艺在您的控制之下，”他说。“LC-MS 也是研究分子高阶结构的理想选择，这与这些生物治疗药物的折叠和稳定性有关，以及它们如何与蛋白质靶标相互作用，或者在涉及分子聚集等问题时与它们自身相互作用。”
Berger 指出，通过LC-MS 获得的结构信息可以推动产品开发，也可以形成知识产权的基础。“了解高阶结构和稳定性动力学可能需要使用氢氘交换或离子迁移质谱 (IMS-MS) 等技术以及碰撞诱导解折叠 (CIU) 等最新技术。CIU是一种质谱仪几乎就像热量计的方法，为蛋白质分子增加能量并观察它在IMS-MS 中如何解折叠，”他说。“这些技术使您可以提出超越一级结构的问题，以了解其折叠结构的动力学及其与蛋白质靶标的相互作用。”
Courtney 强调了对蛋白质表征很重要的三种技术：“高分辨率、高灵敏度、用于蛋白质和聚糖鉴定的轨道阱质谱以及结构解析；毛细管电泳以确定电荷异质性；和针对二级结构的圆二色谱。”
尽管没有单一的标准技术来表征蛋白质，但Vollmer 同意 LC 和高分辨率 MS 被视为黄金标准，这要归功于此类技术提供的有关蛋白质理化性质的“丰富”信息。“其它替代技术是毛细管电泳 (CE) 和CE-MS，因为它们可以提供出色的分辨率，”他补充道。
“光谱方法，如紫外、拉曼、近红外或荧光，也被广泛应用于确定更具体的要求，如浓度或纯度。这些技术速度很快，甚至可以在线应用，”Vollmer总结道。“细胞分析技术，例如代谢分析仪、实时细胞分析仪、细胞成像仪和细胞计数器，可用于表征适合蛋白质生产的克隆和宿主细胞。”
原文：F. Thomas,“Empowering Protein Characterization,” BioPharm International 35 (3) (2022).
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