用于灌流细胞培养规模缩小模型的传感器技术
过程中控制（IPC）
在生物反应器中定期取样和离线表征各种参数的操作通常被称为IPC。例如，活细胞密度、pH值以及葡萄糖和乳酸等代谢物可以根据每日采集的合适样品进行定量。然后用得到的pH值来修正相对设定值可能出现的偏差，而关于细胞密度和活性的信息用来观察培养的进展。代谢物浓度如葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸和氨也常用来监测这一过程。特别是，从葡萄糖浓度中计算出防止其完全耗尽所需的补液添加量。显然，用于细胞培养物离线监测的方法不受操作模式的影响，无论是批次操作还是连续操作。因此，我们在这里不提供在这个方向上的许多可能性的介绍，感兴趣的读者参考专门的文献。
与在线监测和控制相比，IPC - 每天进行采样、样品制备和分析 - 显然更耗时，效率更低，尽管一般情况下可以获取更多的培养物和相关生物分子的特性。例如，考虑到代谢物的定量，样品首先需要离心和过滤。对耗竭培养基(例如氨基酸或维生素浓度) 和关键产品质量属性(N-链糖基化、片段、聚集和电荷异构体) 的其它定量通常只在培养结束时按单个序列进行。事实上，在这些情况下，样品制备需要更多的时间，不能每日进行。表3.1报告了在典型生物反应器运行期间测量的参数和相应所需的样品制备。
使用光谱学技术的、更先进的在线监测确实存在，并正在不断开发中。这些方法可以替代之前提到的一些每日或在运行结束时使用的方法，从而实现更快、更可靠的进程监控。下文将讨论其中一些方法。
光谱传感器
光谱学方法基于物质和电磁辐射之间的相互作用，为使用频率广泛的许多分析技术奠定了基础。这些包括紫外（UV）、近红外（NIR）、中红外（MIR）、拉曼和荧光光谱，可用于获得不同材料的光谱特性，从中导出有关材料原子、分子甚至晶体结构的信息。其中一些技术和相应的波长如图 3.9 所示。
表3.1 在细胞培养过程中通常监测的参数。它们的频率可能非常不同，范围从在线监测到每日采样，再到运行结束后的表征。
不同的光谱技术被用来监测在线哺乳动物细胞培养，以测量单个数值，或者与化学计量建模技术相结合，同时测量多个数值。这里将讨论这些技术的潜力和局限性，并重点关注其中一些似乎最有前途的技术。这些技术中的大多数还不够成熟，无法进行常规应用，但由于开发越来越高效的过程分析技术 (PAT) 的巨大潜力，特别是在连续生物生产的背景下，不难预测它们将在不久的将来强劲成长。目前，在大多数情况下，只有温度、溶解的 O2/CO2 和 pH 值是在线控制的。然而，使用这些新的监测技术，这种情况可能会改变。例如，可以基于一些先进的监控技术在线和按需准备补液液流。
值得一提的是，此类在线数据所包含的信息量非常大。需要基于多变量数据分析 (MVDA) 的更复杂的实时数据处理，可能需要与合适的机械模型相结合，以提取信息，从而直接在反应器监测中实施。在下文中，我们将重点介绍与连续培养相关的最有前途的技术。
介电光谱。与图 3.9 所示的技术相比，介电光谱法是基于外部场与样品的电偶极矩的相互作用；它甚至在几十年前就被用来定量生物量。该技术基于细胞与周围介质的介电相互作用作为频率的函数。由于活细胞是极化的，它们的膜会保留一些向电极移动的离子，从而产生极化电位，该电位以电容 (pF) 值的形式测量。为了独立于探针的几何形状，电容被归一化为介电常数值(pF/cm)。
图3.9 电磁波长谱及其对应的光学和光谱分析技术范围。
使用这种技术只能检测活细胞，因为正在经历细胞凋亡或坏死的细胞膜是多孔的，不能被极化。因此，介电常数受活生物量的影响，通过细胞直径 d（假设为球形）与 VCD 关联，如下所示：
还受到细胞培养中影响其介电特性的许多其它参数的影响，包括细胞可能经历的一些生理变化。然而，事实证明，这些传感器对于在线监测活细胞密度非常有效。这是通过建立介电常数和活细胞密度之间的适当相关性来完成的，基于细胞计数器离线进行的 VCD 测量。在细胞代谢，特别是直径在整个培养过程中相当恒定的情况下，这些相关性是线性的，如图 3.10 所示。
图3.10介电常数信号与离线测量的活细胞密度的线性相关性。
正如 Ansorge（2010）、Zalai（2015）和Zhang（2015）等人所报道的，介电光谱已被用于控制补料分批生物反应器。补液流速与细胞生长速率相适应，不仅可以减少运行间的可变性，还可以提高培养物的性能。对于灌流细胞培养，该传感器通常用于控制废弃率，如 Dowd（2003 年）、Karst（2016) 和 Warikoo （2012）等人所报道的。这种对细胞培养行为变化的实时反应可以更快地达到稳定的生物量浓度。
然而，值得指出的是，保持恒定的介电常数意味着保持反应器中的总生物量恒定。这相当于仅在细胞大小保持恒定时才控制活细胞密度，继而，两者之间的相关性，如图 3.10 所示的线性相关性，在整个培养过程中保持不变。
下面的例子非常清楚地说明了这个概念。通过在生物反应器中保持恒定的介电常数信号，在 26 天的长期灌流运行中培养两个克隆，其生产相同的单克隆抗体。在两次运行中，细胞以0.5×106 cells/mL 的相似 VCD 接种（图 3.11A）。3 天后以 1.0 RV/day的目标值开始灌流，一旦达到 70 pF/cm 的介电常数设定点（图 3.11B）就开始废弃，对于这两个克隆，均在第 11 天。对于克隆 1，此时的 VCD 约为 63 × 106cells/mL，而对于克隆 2，约为 40 × 106（图 3.11A）。另一方面，第一种细胞直径等于 14.7 μm，第二种细胞直径等于 16.5 μm（图 3.11C）。请注意，这两个值都是离线测量的，根据这些值，图 3.11B 所示反应器中的生物量百分比使用公式（3.4）计算。因此，我们看到达到相同的介电常数值后，两种培养物表现出相同的生物量，尽管 VCD（和细胞直径）值不同。第 11 天后，正如预期的那样，由于控制作用，两个克隆的介电常数保持恒定 70 pF/cm。然而，VCD 的行为明显不同。特别是，对于克隆 1，VCD 在第 11 天和第 17 天之间从 63 缓慢下降到 42 × 106 cells/mL，然后在其余培养过程中保持稳定。相反，对于克隆 2，VCD 保持恒定并稳定在 40 × 106 cells/mL 左右，直到培养结束。与 VCD 类似，两个克隆的细胞大小行为也不同。对于克隆 1，细胞直径从第 11 天的 14.7 μm 增加到大约 17.5 μm的平台值（图 3.11C），而对于克隆 2，观察到类似的行为，细胞直径在16.5 - 17 μm。在这两种情况下，如图 3.11B 所示，反应器生物量的计算值基本保持恒定，正如受控介电常数的恒定值所预期的那样。
图3.11 两个不同克隆（克隆 1，克隆2）在恒定介电常数设定点下进行长期灌流：（A）VCD 和活性、（B）介电常数、介电常数设定点（红色虚线）和使用公式（3.4）计算的生物量)、(C) 细胞直径、(D) 葡萄糖浓度和渗透压、(E) 滴度以及 (F) 聚糖 G0 和 (G1+G2) 。
有趣的是，图 3.11 D-F 中的葡萄糖浓度、渗透压、mAb 浓度和产品质量（即聚糖模式）的值在第 11 天后的整个培养过程中保持不变。这表明对于两个克隆，基于总生物量的控制成功保持了稳定的生物反应器稳态，独立于 VCD 的行为，实际上是克隆特异性的。
前面的实验特别表明，我们必须区分至少两种类型的细胞行为。在第一个中，对于克隆 2，细胞直径与细胞状态无关，或者在达到目标介电常数/生物量设定点并进入生产阶段后仅显示轻微变化。在这种情况下，不需要区分活细胞密度和生物量，并且可以通过总生物量控制在稳态下运行。在第二种行为中，对于克隆 1，直径仍在变化，通常在总生物量达到稳定期后的几天内增加。因此，恒定的生物量并不意味着恒定的 VCD，然后稳态运行变得有问题。然而，至少对于这里研究的案例，在恒定生物量条件下操作仍然能够保持恒定的代谢和 mAb 水平，以及产品质量（图 3.11D-F），而与 VCD 值的变化无关。不过，细胞直径正在变化的事实表明，由于细胞代谢的某些演变仍在明显发生，因此实际上尚未达到稳态条件。
拉曼光谱。拉曼光谱基于指向分析物的单色光的非弹性散射，从而导致波长偏移。尽管只有一小部分光子是非弹性散射的（即大约 109 或 1010 中的一个），但它们携带了大量信息，因此提供了可用于识别和量化的分析物的真实光谱指纹。通常，拉曼光谱仪包括三个组件：提供高强度单色光源的激光器、多个采样光学器件和能够采集拉曼光谱的检测器。
拉曼光谱是一种不需要取样的非破坏性原位分析方法。这是一种强大的技术，原则上可以同时监测多个量。此外，它还提供重要的在线过程信息。在哺乳动物细胞培养的情况下，最后一个特征可能也是最吸引人的。
使用这种传感器的主要困难与从测量的光谱中提取所需信息有关。在干净的样品中，分子结构少且简单，光谱中可以观察到明显的峰，每个峰都与样品成分直接相关。然而，在复杂的样品中，例如在含有大量拉曼活性化学和生物物质的细胞培养物的情况中，测量的光谱主要由非常宽的物质组成，其是由与许多相关的峰相对应的重叠产生的物质。因此有必要降低光谱噪声的高含量并强调信息含量。为此，已经开发了基于不同统计方法的各种预处理和建模工具。最常见的一种可能是偏最小二乘 (PLS) 回归。一个关键点是校准步骤，在该步骤中，使用一组适当的离线测量，开发和校准将测量光谱与样品成分相关联的合适模型。该模型随后用于从测量的光谱中预测新样品的组成。由于统计模型本质上有限的外推能力，选择具有足够可变性的合适数据集是获得可靠预测模型的基础。例如，如果一个模型是用一对特定的细胞系和培养基校准的，它不一定适用于细胞系和培养基的其它不同组合。
图3.12 使用 PLS 模型的、基于拉曼的预测与离线测量之间的相关性，包括葡萄糖 (A)、乳酸 (B)、滴度 (C) 和 VCD (D) 。
这显然是该技术的一个限制，尤其是在暴露于多种细胞系和培养基的工艺开发环境中。然而，文献中报道了多个成功的拉曼技术实施案例。它不仅用于原材料和培养基的表征，还用于监测和控制细胞培养过程中的各种参数。这些包括各种代谢物的浓度，如葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸和氨以及活细胞/总细胞密度。关于过程控制应用，Berry 等人（2016 年）基于通过拉曼传感器进行的在线葡萄糖测量，调整了半连续葡萄糖补液速率，目的是降低异常蛋白质糖基化的形成。Matthews等人(2016) 使用拉曼光谱监测乳酸和葡萄糖水平，并调整葡萄糖补液，以将乳酸保持在一定水平以下，同时避免总葡萄糖耗尽。使用这种方法，可以显著延长培养时间，最终滴度增加了 85%。
为了说明这项技术的潜力，图 3.12 比较了代表性工业哺乳动物细胞培养中基于拉曼的葡萄糖和乳酸浓度、滴度和活细胞密度的预测，作为通过经典离线分析技术测量的相应量的函数。在这个比较中，基于 PLS 的模型在对6个不同批次运行的小但有代表性的数据集进行训练后使用。5次运行用于交叉验证，而第6次为预测，导致预测中的一定相对均方根误差（relRMSEP）。通过循环的方式重复这个过程，以便对每个批次运行进行一次预测。得到的结果也在同一图中显示在不同旋转给出的误差的平均值(av-relRMSEP)和相应的标准偏差(STD)。可以看到，预测很好地围绕着穿过原点的对角线，有轻微的散射，这对于VCD是最大的。得到的比较确实令人满意，并证明拉曼光谱确实有潜力在线提供有关该过程行为的多个相关信息。值得一提的是，模型预测的准确性和稳健性通常可以通过向校准集添加更多适当选择的数据来提高。
拉曼光谱在灌流培养中的一个非常有吸引力的应用可能是在线定义是否已达到稳态条件，因为它对生物反应器组成的微小变化很敏感。此前讨论的主成分分析(PCA) 在这种情况下对量化小的光谱变化并指示测量模式和过程演变非常有用。因此，可以检测到稳态的微小漂移，并且可以触发适当的控制动作。其它潜在的应用包括控制入口和出口反应器液流，例如通过监测 VCD 进行细胞废弃，或控制专用于维持非常低水平的葡萄糖浓度的独立葡萄糖补液泵。由于存在使用单个光谱的可能性，因此单个探针可以同时可靠地监测多个参数，使拉曼成为一项非常有前途的技术，我们将看到它越来越多地用于过程监测。
近红外和中红外光谱（NIR 和 MIR）。红外光谱是另一种用于量化细胞培养过程中多种属性的技术。特别是，近红外 (NIR) 和中红外 (MIR) 是指分别在 0.75-1.4 μm和8-15 μm波长范围内工作的红外光谱。NIR 比 MIR 更容易使用且成本更低，但后者提供了更好的分辨率。然而，由于水的高吸光度，MIR 更难使用。
和拉曼光谱一样，其需要合适的化学计量模型来最好地将测量的光谱与必须测量的量相关联。NIR 和 MIR 已在文献中广泛用于估计酵母、真菌和哺乳动物细胞等非常不同类型的培养物中的各种参数。Finn等人（2006 年）报道了使用NIR 来估计基于酵母的工艺中的生物量、葡萄糖、乙醇和蛋白质含量，而 Yeung 等人(2002) 使用相同的技术来监测絮凝过程。此外，还有报道将其用于细胞培养基的原材料筛选。
使用 NIR 或 MIR 监测哺乳动物细胞培养并不常见，实际上从未在灌流应用中得到证实。Arnold（2003 年）和Ducommun (2002) 等人使用原位探针并创建了合适的模型来估计基于 CHO-K1 的工艺中的葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和氨浓度。开发的校准技术为解释原始信号提供了一个可靠的模型，但需要大量的离线测量。
此外，Roychoudhury（2007 年）等人提出了一种用于监测葡萄糖和乳酸的多重校准方法，同样在原位和哺乳动物 CHO 细胞中进行。需要注意的是，到目前为止，红外主要用于细菌发酵，但与拉曼类似，它也具有在哺乳动物细胞培养中用于在线监测的巨大潜力。
总结
在生物制造不断发展的背景下，对灌流生物反应器重燃的兴趣仍然是相对较新的，而市场上可用的大多数相关辅助技术都相对较旧。这就解释了为什么用于监测和控制灌流生物反应器的规模缩小模型和系统相对稀缺。事实上，事情正在迅速变化，我们观察到来自不同供应商的这种类型的设备（通常称为 PAT）的可用性快速提高。这也适用于数字化技术，预计在未来将更多地进入生物工艺领域。这将改变我们今天设计和开发工业化灌流生物反应器的方式。
在本章中，我们讨论了用于灌流培养的规模缩小技术的可用性 - 实际上，在大多数情况下，是缺乏技术。灌流的连续性和细胞截留的需要使得纳升和毫升规模的设备的设计和实现在技术上很困难。为此，已经开发了半连续操作来模拟灌流，至少以离散的形式。第 1 章中的表 1.3 总结了目前主要基于这种方法可用作灌流规模缩小模型的设备及其各自的监测和控制特性。
用于监测和控制灌流培养的在线或至少近线设备也变得越来越普遍，以试图将生物制造推向以自动化和数字化为主的下一阶段。电容是目前用于监测细胞生物量最常见的在线测量变量。拉曼光谱似乎非常有希望同时监测多个变量 - 如滴度、营养物、代谢物，可能还有一些与产品质量相关的变量，如蛋白质聚体或糖型。
先进的在线监测技术目前主要应用于实验室规模，但通过在自动化微型生物反应器中使用它们也可以获得巨大的好处，例如本节中描述的那些。再加上现有的高度自动化，这些可以允许以更小的外部交互来驱动工艺。例如，可以避免为了细胞计数而进行采样，并且可以根据实时传感器信息控制灌流速率或废弃率。
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原文：M.Wolf, J-M.Biesler, M.Morbidelli, Perfusion Cell Culture Processes for Biopharmaceuticals. Process Development, Design, and Scale-up, 2020.
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