用作细胞灌流培养规模缩小模型的高通量技术平台
纳流控芯片
在之前的文章中，我们介绍了在建立新的生产细胞系时，在克隆筛选中遇到的挑战。Berkley Lights 开发了一个完全集成的平台 (Beacon)，其使用光电定位技术在纳米流体培养芯片上执行和操作细胞。可以通过专用软件，对常见的细胞培养任务进行编程，该软件还可以对数千个细胞系进行并行维护和分析。该技术允许将单个细胞多重沉积到具有纳升体积的单个腔室阵列中。整个芯片可以在 8 分钟内成像 - 包括基于人工智能的细胞计数、克隆性监测和所有克隆的生长，以及通过荧光分析对抗体分泌进行评分。这样，可以估计相对蛋白质生产力，并且只能选择具有可接受生产力水平的克隆。该技术尚未在工业中用于以灌流模式筛选克隆，但原则上，可以使用沿通道的恒定培养基液流来应用连续培养基交换。这种层流和通道之间的界面将使一些置换能够补充营养并排出有毒废物代谢物。已经表明，该技术不仅减少了建立克隆细胞系的工作量，而且还允许对所有类型的生产过程进行有效的克隆选择。特别是，该系统允许选择具有稀有表型或理想特征的细胞，例如补料分批工艺中的高生产力或长期灌流运行的稳定生长和生产力。
这项技术目前专门用于细胞系筛选，但在这里进行讨论是因为它非常具有创新性，并且它是唯一已知的能够在这种规模下通过连续培养基置换而培养单细胞的设备。
用作规模缩小模型的孵育设备
在本文中，我们将介绍在能够维持可行培养条件的受控环境中培养的培养装置，例如锥形管、摇管或深孔板。通常情况下，温度、湿度和CO2在孵育环境本身中得到控制，并使用搅拌来促进混合和O2向培养物的传输。
这些培养装置是封闭的，以保持无菌状态，透气膜允许氧气和CO2传输。氧气从空气输送到液体悬液中，并被细胞消耗，这是由液相中的搅拌和气液界面的表面积控制的。由于这些条件都只能达到适中水平，因此这些设备中的氧气供应可能会成为一个问题。纯氧有时用于台式生物反应器的鼓泡系列，但出于安全原因，它不是孵育设备的选择。在这些设备中，pH 既不受监测也不受控制，而是使用基于碳酸氢钠和空气中CO2 平衡的缓冲系统。以下方程式描述了碳酸氢钠在与 CO2 保持平衡时分解为弱酸性碳酸盐和氢氧化物的缓冲系统：
还值得注意的是，在这些设备中，从培养悬液中去除 CO2 的效率不是很高，因为缺少脱气效应（台式生物反应器中气泡上升的特征）。另一方面，搅拌通常足以确保有效的热传递和细胞悬液令人满意的均匀性。此外，必须根据工作体积设计取样策略，这在不同设备之间可能会有很大差异，如下文中详细描述的那样。
摇管和深孔板
摇管被开发用作哺乳动物细胞培养的规模缩小模型。它们通常是 50 mL 试管，设计用于带振摇搅拌的孵育设备（图 3.1）。通过改变试管中的培养体积以及振摇条件，可以优化特定的气液界面表面积。当振摇增加时，管中的相间表面积增加。
取样、接种、补液等操作由操作员在层流罩下手动完成，以确保无菌。这些模型的培养体积足以在细胞密度、代谢物浓度、渗透压、耗竭的培养基分析、产品定量和产品质量评估方面对细胞培养物进行全面表征。另一方面，在培养过程中不监测或控制 pH 和 DO。
图 3.1 不同尺寸的摇管。黄色帽上的白点对应于透气膜，可保持系统无菌，同时保持孵育舱和管内的气相平衡。
图 3.2 左侧为一个没有盖子的 96 深孔板（顶部）和一个带有金属盖的培养箱（底部）。右侧是用于液体处理的机器人平台。该平台必须放置在层流罩下才能在无菌条件下工作。图中所示为Beckman Coulter 的Biomek® i7 自动化工作站。
除了摇管技术，深孔板与传统孔板非常相似，但更深，因此可提供更大的培养体积，是孵育设备应用的一种有前途的替代品（图 3.2）。它们有不同的形式（6-96 孔），可用于悬浮细胞生长，类似于摇管。在培养过程中，盘子上覆盖着一个可透气但用作无菌屏障的盖子。通过将深孔板放入培养箱中，可以控制振摇搅拌、pH 和氧气转移，就像在摇管中一样。必须仔细选择工作体积和搅拌速度，以保证足够的氧气通过气液界面和良好的混合条件。
由于并行运行如此大量的实验，手动处理是不可行的，必须使用机器人平台进行液体处理。这些设备可以通过编程对每个板进行采样、接种和补液。例如，在 96 深孔板中，可以在每个孔中独立混合不同的培养基，从而在同一实验中创建 96 种不同的培养基成分。不同的机械臂要么使用 96 个吸头，例如一次对整个板进行采样，要么使用独立的吸头，这些吸头可以编程为仅向特定孔添加/去除特定数量的液体。当然，这些设备提供了非常高的吞吐量，因此最适合培养基混合和筛选应用。然而，体积较低，尤其是 96 孔形式，可能会对分析造成限制。质量属性表征通常需要大量蛋白质，而这些蛋白质不能总是能在如此小的体积下获得。如果产品浓度足够高，可以通过抽出整个体积然后停止该孔来“牺牲”一孔。这主要在批次或补料分批实验结束时进行。
深孔板的许多应用可以在文献中找到。其中大多数针对培养基混合研究，例如 Jordan 等人关于氨基酸组成的研究，其中产生和分析了多达 192 种不同的条件。Rouiller 等人产生了 376 种不同的条件，从 16 种培养基配方开始，并从 47 种培养基成分中改组了 43 种。在细胞系筛选方面，研究表明，深孔板平台可用于预测更大规模细胞培养的生产力甚至质量属性，从数百个克隆的并行筛选开始，规模放大至摇管，然后是微型生物反应器，最终发展至台式生物反应器。还有研究报告了对产品质量的调查。在这些系统中进行的实验工作流程示意图如图 3.3 所示。
图 3.3 在适当的实验设计后，将定义数量的培养基和选定的克隆添加到板的每个孔中。在细胞培养过程中，培养板孵育，并使用机器人设备对培养物进行取样和补液。高通量细胞计数和蛋白质滴度检测装置用于收集数据。在培养结束时，可以捕获蛋白质以进行进一步的质量属性测量。
所采用的分析设备也必须适应这种高通量形式。例如，对于细胞计数，存在基于流式细胞术技术的各种商业化设备。对于分泌蛋白的定量，可以使用基于荧光标记的高通量解决方案，或者，特别是对于单克隆抗体的情况，使用基于表位结合动力学的检测。
可以注意到，此类系统形式的工作体积都非常小，不可避免地会在最终数据中产生不可忽略的可变性。因此，我们建议将这些技术主要用于筛选或性能排序目的。
孵育系统中的灌流细胞培养策略
摇管和深孔板是用于批次或补料分批工艺开发的成熟系统。具有周期性和受控培养基置换的半连续操作可用于模拟此类设备中的灌流条件。主要步骤是从培养悬浮液中分离细胞 - 例如，通过沉降或离心 - 然后去除上清液或收获培养基。这模拟了真实灌流系统中的收获液流，因为它包含耗竭的培养基、毒性代谢废物以及分泌产物。然后将去除的收获液替换为先前调节过的新鲜培养基，从而模拟灌流液流。
Villiger-Oberbek等人使用此方案达到了 50 × 106 cells/mL 的细胞密度，并以约 30 × 106 cells/mL 维持长期培养超过 58 天。Henry等人使用以半连续模式运行的转瓶预测了灌流培养的一些参数，例如细胞生长、营养消耗、代谢物产生和滴度。Bielser等人使用 96-深孔板和摇管筛选克隆细胞系，确定最佳生产细胞并预测重要的灌流参数，例如 CSPR 和单位体积生产力。Wolf 等人详细讨论了半连续摇管和台式生物反应器中细胞特异性生长、葡萄糖消耗、氨和单克隆抗体生产速率的比较。这些规模缩小的灌流培养模型为生物反应器系统提供了非常有趣的替代方案，因为它们具有更高的通量 - 这使得它们具有吸引力，特别是在筛选和工艺开发的早期阶段。当然，操作的半连续性质也有重要的限制。例如，非常高的细胞密度可能难以维持，因为所需的培养基置换频率可能太高。最合理的置换频率 - 保持置换体积不变 - 与灌流速率成正比，实际上仅限于一天一次。两次需要 12 小时的间隔，这会带来一些问题。在足够高的细胞密度下，摇管和深孔板系统都可能出现氧转移限制。此外，这些系统中的 pH 值没有得到很好的调节，这可能会改变产品质量甚至是整体培养性能。综上所述，尽管这些规模缩小的灌流模型远非完美，但它们仍然不仅可用于筛选目的，还可用于估计基本操作参数的初步“猜测”，例如用于更大规模的灌流生物反应器最小 CSPR。
波浪式生物反应器
波浪式生物反应器是细胞培养中一种非常传统的技术，它已经拥有了一个自己的类别。它们的名字不言自明：它们是装满培养基的袋子，放在一个平面上，在两个角度之间连续摆动。它们的操作更像是一个孵育装置，而不是一个受控的生物反应器。袋子下面的表面被加热并通过靠近袋子的温度计进行调节以保持温度值。气体混合物通过渗透性过滤器引入袋中。由于较大的表面-体积比，这通常可提供气态物质的充分交换。
尽管波浪式生物反应器过去曾用于灌流细胞培养，但它们主要用于种子培养，而不是与工艺开发相关的工作。例如，在种子培养中使用密度为 90 至 100×106 cells/mL 的高浓度 5 mL 细胞库冻存管，而不是更传统的低密度库，最多可以节省 9个细胞扩增的天数。从操作的角度来看，这非常重要，因为它缩短了细胞复苏和生产生物反应器接种之间的时间间隔。波浪式生物反应器是生成高密度细胞库的理想选择，因为它们可以处理的体积足以涵盖大量细胞冻存管，这一步不需要大的实验吞吐量。
图 3.4 波浪式生物反应器的原理：摇摆运动产生波浪和湍流，有利于氧气转移和细胞悬液的混合。袋子用所需的气体混合物（通常是空气和CO2）充气。
已有文献报道了使用结合切向流过滤（TFF 或 ATF）的波浪式生物反应器进行灌流培养操作的一些应用。据报道，高达 130 × 106 cells/mL 的细胞密度可维持长达 20天，峰值可达 214 × 106 cells/mL，这个结果令人印象深刻。有趣的是，这些结果是通过这些系统的高气液传质速率特性实现的，这来自与其它培养装置相比，其更大的悬液表面积与体积比。泡沫形成在这些装置中也不常见。然而，目前行业并不考虑将波浪式生物反应器用于工业生产，因为为这些袋子提供搅动的摇摆运动方式限制了它们的规模放大，其所需的能量必须足以运动整体培养体积，这在考虑数千升的袋子时可行性不高。
自动化微型生物反应器
所谓的微型生物反应器是市场上可用的最小规模的生物反应器之一。它们以两种不同的规模存在，15 和 250 mL 工作体积，并且以15 mL 规模和 250 mL 规模的 24 或 48 联反应器模块运行。操作员可以对机器人平台进行编程，以执行不同的任务，例如采样和补液，还可以监测和控制不同培养参数的设定点。该平台可以使用机械臂和无菌吸头进行液体处理，气体管线直接连接到生物反应器，通过叶轮提供搅拌，生物反应器所在的工位可以进行温度控制。与 96-深孔板或纳米流芯片技术相比，毫升级别的工作体积已经相当高了，因此，相比筛选应用，摇管和 ambr® 系统都更适合于工艺开发的早期阶段。
这些设备的示例如下图所示，其中容器为一次性形式，包括 pH 和 DO 监测探针。微型生物反应器的优势显然是与传统的台式生物反应器相比，实验通量显著提高。这也是通过采样和补液的高度自动化来实现的，不需要任何人工干预。
ambr®250 是一个非常新的设备，但它已被证明是一种有效的规模缩小模型。Xu等人报告称，使用气液传质速率作为规模缩小参数，可以在 ambr®250以及5 和 1,000 L 生物反应器中产生可比的细胞生长和蛋白质生产曲线。
图3.5 用于 24 联生物反应器的ambr® 15 高通量工作站（左）和为该平台设计的 15mL 一次性生物反应器示意图，Sartorius Stedim Biotech。
图3.6 用于 24 联生物反应器（左）的ambr® 250 高通量工作站和平台中使用的 250 mL 一次性生物反应器示意图，Sartorius Stedim Biotech。
在上述两种设备中，细胞密度、代谢物浓度和质量属性的监测都是通过离线或在线采样完成的。为此，由于体积限制，15 mL 形式可能不适合，特别是在随时间监测质量属性的情况下，采样体积相对于培养体积可能变得过大。因此，在计划一系列实验时，例如在设计实验程序的情况下，必须验证细胞培养工艺中所需的样本量，以确保最大值和最小值在相应设备可提供的范围内。
尽管这些系统最初设计用于模拟批次和补料分批操作，但通过引入连续的培养基置换和细胞截留来扩展灌流培养是可能的，尽管并不简单。在这些平台中，生物反应器固定在搅拌模块中，每个模块可容纳12个生物反应器。这使得处理用于半连续操作的生物反应器很麻烦。然而，Janoschek 等人使用离心，类似于前面对摇管和深孔板装置的描述，以 30 × 106 cells/mL 的密度保持稳态条件，持续约一周。为了在不去除细胞的情况下用新鲜培养基替换耗竭的培养基，另一种方法是让这些细胞在生物反应器中沉淀。为此，应停止搅拌和通气一段时间，直到细胞沉淀。这肯定会导致氧气需求方面的问题，特别是在更高细胞密度的情况下。尽管如此，15 mL 规模的自动化微型生物反应器 (ambr®) 系统仍是非常方便的选择，因为它具有高度自动化，允许使用专用软件对沉降和培养基置换步骤进行编程。该系统允许以每天最多两个反应器体积的中等置换速率运行，并且沉降可获得超过 95% 的细胞分离效率。
图3.7 用于在ambr® 250上进行灌流细胞培养的机器人平台和一次性生物反应器。生物反应器连接至中空纤维，可按TFF或ATF模式进行操作。Sartorius Stedim Biotech。
由于认识到需要真正的灌流装置，Sartorius为 ambr® 250 开发了一种新型生物反应器。这些生物反应器配备了中空纤维组件，如上图所示，可用于 TFF 或ATF 模式的操作。
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原文：M.Wolf, J-M.Biesler, M.Morbidelli, Perfusion Cell Culture Processes for Biopharmaceuticals. Process Development, Design, and Scale-up, 2020.
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