【催化】ACS Catal.：立体互补老黄酶催化C=C键异构化反应的不对称质子转移

研究现状

老黄酶（OYE）可催化碳碳键形成反应，如不对称碳环化、α-溴酯的对映选择性脱卤、光催化剂存在下的羰基还原、光激发下的α-氯酰胺的不对称自由基脱卤/环化和光诱导分子间自由基氢化反应。不同OYE催化的非天然反应有一个共同点：依赖外源电子还原黄素辅酶引发反应，其中来源于酿酒酵母的OYE2催化α-当归内酯（1）发生异构化生成β-当归内酯（2）的反应不依赖于NAD(P)H。

C=C键的酶异构化在自然界中广泛存在，依赖于多种蛋白质和相应的机制（方案1A），考虑到这些底物的取代模式，异构化反应不会产生立体中心。几种同源OYE可催化3-亚甲基二氢呋喃-2(3H)-酮发生异构化反应（方案1B1），且具有独特的催化机制：将黄素的氢转移至碳碳双键以引发反应，导致形式分子内的氢迁移，理论上只需要催化量的NAD(P)H。

方案1. 生物催化C=C键异构化反应综述。A.酸碱催化和B.氢化物依赖机理

（来源：ACS Catal.）

为了鉴定用于不对称C=C键异构化反应的立体选择性酶，近日，奥地利格拉茨大学的Mélanie Hall课题组将筛选工作扩展到未探明来源的OYEs上，该课题发现两个同源性较低（21%）的OYE催化1的异构化反应具有高的立体选择性和立体互补性。作者解析了两种新的晶体结构，并通过浸泡实验和突变研究解析了其独特的催化机制：通过立体发散方式进行不对称的质子转移（方案2）。

方案2. 通过立体互补方式，同源OYE将α-当归内酯（1）立体选择性地异构化为β-当归内酯（2）（来源：ACS Catal.）

重组蛋白纯化与性质

根据其一级晶体结构，来源于藻类Galdieria sulphuraria的OYE（GsOYE）被归为I型OYE。来源于真菌Botryotinia fuckeliana的BfOYE4被归为III型OYE。两者分别在大肠杆菌中过表达，都可获得纯且可溶的OYE，但BfOYE4的表达量较低（7 mg/L）。

异构化反应

OYE催化1的异构化反应如下：将200−400 μg/mL（∼5−10 μM, 0.05−0.1 mol%）加入到含有10 mM 1的Tris-HCl（50 mM）缓冲液中，助溶剂为2 vol% DMSO，在30 °C、250 rpm条件下反应过夜，结果如表1所示。在无NAD(P)H的情况下，2是唯一产物，手性GC显示萃取产物呈现立体发散形式（方案2）：GsOYE催化1以高达88%的ee值生成(R)-2；而BfOYE4催化1以高达98%的ee值生成(S)-2。作者还筛选了在不同pH下，三种OYE催化产物的旋光度的差异（表2）。

表1. pH值对OYE催化1异构化生成2的影响（来源：ACS Catal.）

表2. rac-2在pH 9条件下与选定酶的“反向”异构化反应（来源：ACS Catal.）

晶体结构与浸泡实验

GsOYE与1的复合物晶体结构清晰地显示出其H174和N177的碳基与1之间的氢键（图1A），Y66和Y179的羟基都朝向1的前手性γ-碳，GsOYE中Y66和Y179分别对应于OYE2中的Y83和Y197。1与GsOYE晶体孵育7 h后，在酶活性位点检测到的电子密度主要为(R)型产物2，表明晶体内发生了立体选择性异构化（图1B）。Y66虽然也接近γ-碳原子，但在与Y179的羟基直接相互作用方面表现出更好的构型，两个Tyr氧原子之间的距离为2.7 Å，相比之下，这个距离在非选择性异构酶OYE2中更大（Y83和Y197之间距离为4.7 Å，图2）。

图1. GsOYE与1形成配合物的时间过程晶体学研究。A）45分钟后，酶活性位点中主要化合物仍是1；B）7小时后，酶促反应产物(R)-2堆叠在FMN辅因子顶部（来源：ACS Catal.）

来源于Propionibacterium acnes的多元不饱和脂肪酸异构酶（PAI）也是一种黄素依赖性酶，以不可逆形式催化亚油酸生成10,12-共轭亚油酸，通过FAD的N5夺取底物C11处氢原子引发反应，生成的碳阳离子B2_Int1随后发生烯丙基异构，氢原子进攻B2_Int2的C9位，导致分子内氢原子的迁移并生成二烯产物（方案1B2）。

图2. (R)-异构酶GsOYE（青色）和非选择性异构酶OYE2（橙色）的结构叠加图（来源：ACS Catal.）

突变实验

基于对晶体结构的分析，作者选择几个可能发挥酸碱催化性质的氨基酸进行突变，多个单突变体被用于催化从1生成2的异构化反应和化合物3的还原反应。对于GsOYE，因T25位于远离1的α-碳处（图1），故T25C对1的异构化反应无明显影响。N270、Y346、Y179和Y66均临近底物，突变体对反应的影响如表3所示。各个氨基酸在1的异构化反应中所起的作用如方案3所示。浸泡实验表明Y179在GsOYE中似乎是作为C=C键Si面立体选择性的质子供体。与Y179羟基形成氢键且与底物1较远的Y66参与了催化作用，但不参与底物的直接质子化。Y66可能通过传递质子参与Y179的再生（方案3A）。这就可以解释Y66F活性较低的现象，因为Y179在水环境中再生较慢，且通过该突变体获得的产物具有较高的ee值。

表3. 与野生型相比，GsOYE突变体催化1生成(S)-2异构化反应和3的还原反应的影响（来源：ACS Catal.）

方案3. 作者基于突变研究、晶体结构和浸泡实验提出的GsOYE和BfOYE4将 1异构化为A）(R)-2和B）(S)-2的催化机制（来源：ACS Catal.）

对于BfOYE4，突变体对异构化反应的影响如表4。因无复合物晶体结构，故推测催化机理如下：（1）Y235使1的α-碳发生去质子化；（2）K157通过去质子化作用恢复Y235的活性；（3）Y78立体选择性地在C=C键的Re面使烯醇中间体重新质子化，即形成产物(S)-2（方案3B）。

表4. 与野生型相比，BfOYE4突变体催化1生成(S)-2异构化反应和3的还原反应的影响（来源：ACS Catal.）

总结：黄素依赖性老黄酶（OYEs）天然和混杂的催化活性是通过电子转移过程中还原黄素引发的。作为罕见的例外，两个非立体选择性OYEs可以催化不依赖于氢的非活化C=C键发生异构化反应。作者报道了来源于海藻和真菌的立体互补老黄酶，其可以催化前手性模型底物γ-甲基β,γ-丁烯内酯以高达99% ee值异构化生成(R)-和(S)-对映体。基于新解析的两种晶体结构、浸泡实验和定点突变，作者解析了部分非保守酪氨酸残基对(R)-和(S)-异构酶活性和立体选择性的关键作用。这项研究以独特的视角表明了黄素蛋白在非氧化还原催化中的潜力，并为其在可能的立体发散类OYEs中寻找烯烃异构酶提供了线索。

论文信息：

Asymmetric Proton Transfer Catalysis by Stereocomplementary Old Yellow Enzymes for C=C Bond Isomerization Reaction

Marina S. Robescu, Laura Cendron, Arianna Bacchin, Karla Wagner, Tamara Reiter, Ignacy Janicki, Kemal Merusic, Maximilian Illek, Matteo Aleotti, Elisabetta Bergantino, and Mélanie Hall^*

ACS Catal. DOI: 10.1021/acscatal.2c01110

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