华南理工何春茂组和华科大廖荣臻组合作ACS Catal: 工程改造NO转运蛋白Nitrophorin 2用于催化烯烃环丙烷化

导语

近年来，无论在学术界还是工业界，生物催化对于部分精细化学品的获取已经占据了不可替代的位置。许多工程酶能够以无可比拟的选择性催化生物反应，甚至对一些最复杂的有机催化剂难以催化的非生物反应也能实现高效转化。环丙烷是一种常见的药效结构单元，在新药开发中占据重要的地位。前人在生物大分子催化烯烃环丙烷化方面做了大量的研究，以2018年诺贝尔化学奖得主Arnold教授等为代表的科学家基于P450_BM3和Myoglobin（Mb）等血红素蛋白质改造获得了系列人工金属酶，在催化烯烃底物环丙烷化中实现了极高的产率、对映选择性和非对映选择性。进一步地，人们通过改变血红素结构、替换血红素蛋白质的近端轴向配体或全新设计的蛋白质骨架等策略提高了催化活性、拓宽了底物范围。然而，迄今报道的绝大多数该类人工金属酶含有α-螺旋蛋白骨架，极大地限制了催化底物的拓展，因此，有必要发展基于不同类型蛋白骨架的生物催化体系。近日，华南理工大学化学与化工学院何春茂教授团队在该领域取得了进展，相关研究成果以“Repurposing a Nitric Oxide Transport Hemoprotein Nitrophorin 2 for Olefin Cyclopropanation”为题发表在ACS Catal., 2022（DOI: 10.1021/acscatal.2c03515）。

前沿科研成果

近日，华南理工大学化学与化工学院何春茂教授团队基于β-桶状蛋白质Nitrophorin 2（NP2）骨架，通过理性设计和定点突变，筛选获得了三突变体NP2（L122V/L132V/I120V），其具有高的催化效率（产率最高可达99%，TTN最高可达2680）和优异的选择性（de 99%，ee 99.9%）。与P450_BM3、Mb等主流α-螺旋血红素卡宾转移酶相比，NP2作为β-桶状蛋白质，表现出了独特的底物偏好。此外，该酶在细胞裂解液水平或者制备规模进行催化，仍能保持原有的高立体选择性和高产率，体现了极佳的实用潜能。华中科技大学廖荣臻教授团队通过DFT计算详细解释了NP2催化苯乙烯环丙烷化反应的立体选择性的来源，阐明了132号位氨基酸残基对高酶催化选择性具有的决定性意义。

图1. 本工作的主要研究内容（来源：ACS Catal.）

首先，作者对NP2蛋白质进行了工程化改造。作者对比了野生型NP2与血红素hemin的催化苯乙烯环丙烷化结果，野生型NP2虽表现出一定的立体选择性，但催化产率略低于血红素hemin。通过蛋白结构分析，作者认为野生型NP2催化产率低可能是由于其催化域血红素远端的氨基酸残基空间位阻大，阻碍了环丙烷化反应的进行。作者经过几轮定点突变，理性设计获得具有最好的催化效果的三突变体NP2（L122V/L132V/I120V）。随后，作者对催化条件（反应体系pH、烯烃底物与重氮底物投料比/投料方式等）进行了优化，大幅提升了催化反应效果。进一步地，作者还进行了细胞裂解液水平的催化研究，结果表明：不仅优异的选择性得到了保持，且实现了更高的催化效率（TTN 2680）。接着，作者进行了底物拓展研究，NP2（L122V/L132V/I120V）催化可获得高达99.9%产率、99.9% de和99.9% ee, 并且对邻位取代苯乙烯烯烃底物表现出特异性偏好。同时，在2 mmol的制备规模反应中，仍能保持原有的高立体选择性（结果见图2）。最后，作者通过DFT计算，解释了反应机理（非自由基反应机理）和立体选择性（1S，2S构型选择），并揭示了132位点是控制催化立体选择性的关键位点，与实验结果相一致。

图2. 酶催化反应底物拓展及部分底物的规模化制备（来源：ACS Catal.）

总之，这项工作开发的新型蛋白骨架NP2扩大了目前的卡宾转移酶催化工具箱，为生物催化重要非天然有机反应提供了更广阔的可能性。
相关结果近期发表在ACS Catalysis上，文章的第一作者是华南理工大学博士生研究生黄顺芝，华中科技大学博士研究生邓文浩在DFT计算上提供了帮助，通讯作者为何春茂教授和廖荣臻教授。该项研究工作受到了国家自然科学基金项目（No. 22077036）和中央高校基本科研业务费（No. 2020ZYGXZR056）的资助。
论文信息： Repurposing a Nitric Oxide Transport Hemoprotein Nitrophorin 2 for Olefin CyclopropanationShunzhi Huang, Wen-Hao Deng, Rong-Zhen Liao,* and Chunmao He*ACS Catal., 2022, DOI: 10.1021/acscatal.2c03515

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何春茂老师简介

教育背景： 2001.09 – 2005.07 太原理工大学 制药工程 本科2005.09 – 2008.07 中国科学院广州化学所 有机化学 硕士2008.09 – 2011.12 德国马普生物无机化学研究所 博士 （导师：Prof. Wolfgang Lubitz）

工作经历及成果： 2012.01 – 2013.05 德国马普化学能源转化研究所 博士后 (导师：Prof. Wolfgang Lubitz）2013.06 – 2015.08 苏黎世联邦理工学院/日本名古屋大学 博士后 (导师：Prof. Jeffrey W. Bode）2015.09 – 2016.08 德国马普化学能源转化研究所 博士后（导师：Prof. Wolfgang Lubitz）2016.08 – 至今 华南理工大学化学与化工学院 教授 2016年受到华南理工大学“杰出人才与团队引进计划”支持加入华南理工大学化学与化工学院。课题组目前研究获得了基金委（青年项目及重大研究计划）、科技部重点研发计划及广州市科创委等的经费支持。


课题组研究致力于发展高效的蛋白质化学合成方法，并用于1）与人体生理病理相关的重要翻译后修饰蛋白质的精确制备及机理研究；2）人工金属蛋白质的构建及功能研究等。

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