JAFC：德国慕尼黑工业大学Martin Steinhaus教授团队发现了菠萝蜜的主要香气物质

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编者按：

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2019年5月3日，德国慕尼黑工业大学Martin Steinhaus教授团队在Journal of Agricultural and Food Chemistry（1区，IF：3.412）发表了题为“Characterization of the Major Odor-Active Compounds in Jackfruit Pulp（菠萝蜜果肉中主要气味活性化合物的表征）”的研究文章，本研究首次全面应用了最先进的方法，鉴定菠萝蜜果肉香气的关键化合物。采用AEDA获取菠萝蜜果肉中获得的挥发性分离物。明确鉴定44种气味活性化合物，成功重组特征菠萝蜜果肉香气，破译了菠萝蜜果肉香气的关键化合物。另外，中国具有大量比较有特色的水果，如湖南永兴冰糖橙，江西赣南脐橙，宜昌秭归脐橙等，如果能系统而正确解密其关键香气物质，阐明甜橙加工过程中香气变化的分子机理，同时也将对其靶向育种开发提供帮助。除此之外，本研究也将为其他食品的主要活性化合物的表征提供帮助。

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科学私享

2019.05.07

第一作者：Johanna E. Grimm

通讯作者：Martin Steinhaus

通讯单位：德国慕尼黑工业大学

DOI: 10.1021/acs.jafc.9b01445

文章概述

通过溶剂萃取和溶剂辅助香气蒸发对菠萝蜜果肉中分离的挥发物进行香气提取物稀释分析，共检测到48种气味物质，其风味稀释（FD）因子在1和≥8192之间。气相色谱-嗅觉测定法在静态顶空样品中的应用揭示了另外五种高挥发性气味物质。53种检测到的气味物质中，有44种结构已确定。使用稳定同位素取代的气味物质作为内标来定量这44种化合物，并且将它们的气味活性值（OAV）计算为菠萝蜜果肉中的天然浓度与水中的气味阈值的比率。特别是对于3-甲基丁酸乙酯（74000），丁酸乙酯（1800），3-甲基丁醛（1500）和2-甲基丙醛（1400）等化合物具有较高的OAV。基于35种化合物的天然浓度的香气模型溶液（其中已经计算出OAV> 1）完全模拟了特征菠萝蜜浆的香气。

▲摘要图

背景介绍

菠萝蜜树，是桑科的常绿热带树。它原产于南亚，但今天在整个热带地区种植。圆柱形多个果实长度可达90 cm的长度，宽度可达50cm，并从树干和老树枝生长【1】。树皮呈革质，黄色，绿色或褐色，并覆盖有特征性的六角形小块。在成熟状态下，树皮和中央纤维花梗之间的空间充满了纤细，坚韧的丝带和许多种子的混合物。每粒种子都被包裹成球状，肉质和可食用的果肉，黄色，甜味和香气可口。果肉主要新鲜食用，但也可以加工成蜜饯，如罐装果肉，干果肉，果酱或糖浆。

成熟菠萝蜜果肉的香气结合了甘甜，果味，麦芽和干酪的味道。虽然已经公布了一些关于菠萝蜜挥发物的研究，但目前对于各种化合物对新鲜果肉的总体香气的贡献知之甚少。大多数研究只关注主要挥发物的结构鉴定，而没有评估其气味活性。在1978年发表的开创性研究中，Swords等人通过真空蒸馏和溶剂萃取分离出菠萝蜜挥发物，通过GC-MS鉴定出19种挥发物，其中有15种酯和4种脂肪醇【2】。进一步的研究运用于马来西亚【3-6】，印度【7】，和巴西种植的水果【8-9】。到目前为止，已发现了大约200种不同的菠萝蜜挥发物。在不同研究中报道的主要菠萝蜜挥发物中有醇类如1-丁醇【2-7,9】， 2-甲基丁-1-醇【3,6,9】，3-甲基丁-1-醇【2-9】，和2-苯基乙醇【4,7,9】，酯如乙酸丁酯【2,3,5,6,8,9 】，乙酸2-甲基丁酯【3,6,8 】，乙酸3-甲基丁酯【3-8】，乙基丁酸，[2,3,6-9] 2-甲基丁酸乙酯【6,8,9】，3-甲基丁酸甲酯【3,4,6-9】，3-丁基丁酸乙酯【2-4,6-9】， 3-甲基丁酸丙酯【2-9】，3-甲基丁酸丁酯【2-9】，2-3-甲基丁酸甲酯【2-4,6-9】， 3-甲基丁酸3-甲基丁酯【3】，[3-甲基丁酸3-甲基丁酸酯【2,4-9】，和己酸甲酯【7,9】，以及酸如3-甲基丁酸【4,5,7,9】。仅一个案例中，应用气相色谱- 嗅觉测定法（GC-O）进行鉴定大多数无关挥发物中最具气味活性的化合物和香气提取物稀释分析（AEDA）【10】的应用揭示了3-甲基丁酸乙（512），丁酸乙酯（256）的最高风味稀释因子（FD因子） ，丁酸丁酯（128）和丁基3-甲基丁酸酯（128），而所有其他52种检测到的气味剂的FD因子相对较低（≤16）【9】。我们自己的初步GC-O实验产生了26种气味活性化合物，其中一些气味剂46以前在菠萝蜜浆中是未知的【11】。

考虑到上文详述的文献概述所示的对单个挥发物的气味活性的零碎知识，本研究的目的是通过使用系统方法鉴定菠萝蜜浆中的主要气味物质，包括1）AEDA的气味筛选和稀释分析。静态顶空样品，2）使用气味剂的稳定同位素作为内标的精确定量，3）气味活性值（OAV）的计算，以及最后4）基于天然气味浓度的香味重组作为成功的证据。

材料与方法

1 菠萝蜜果肉

泰国种植的水果从德国网上商店购买。水果是当地农民在几乎完全成熟时采摘的，并在两天内空运到德国。用小刀小心打开水果，用手从球茎上去除外壳，立即对菠萝蜜果肉进行分析。

2 基准气味物质

1,2,4-8,10,12-16,18,22-27,29-31,37-44,46,47和49-51购自Sigma-Aldrich（Taufkirchen，Germany），3从Lancaster（德国Mühlheim）获得，11和48来自Merck（德国Darmstadt），17,52和53来自Alfa Aesar（德国Karlsruhe），21来自Acros Organics（比利时Geel），19根据先前公布的方法合成【12】。30使用前现时蒸馏。

3 稳定同位素取代的气味物质

（13C4）-17得自Toronto Research Chemicals（Toronto，Canada）。（2H3）-22，（2H8）-43，（13C2）-47和（2H6）-49购自Sigma Aldrich，（2H5）-40购自CDN Isotopes（Quebec，Canada），和（13C2）- 42是从aromaLAB（Planegg，德国）获得。如文献中详述的那样合成以下同位素取代的气味剂：（13C4）-2【13】，（2H3）-4【14】，（13C2）-7【15】，（2H11）-10【16】，（ 2H4）-8【14】，（2H2）-13【17】，（2H2-5）-19【18】，（2H4）-24【19】，（2H3）-25【20】，（2H2）-27【21】，（13C2）-30【22】，（2H2）-31【17】，（2H2）-37 【23】，（2H3）-38【24】，（2H2）-41【25】，（13C2）-46【26】，（2H3）-48【27】，（2H2）-52【28】，和（2H2）- 53【28】。化合物（2H3）-1，（2H3）-3，（2H5）-5，（2H3）-6，（2H3）-12，（2H3）-15，（2H5）-39和（2H5）-44使用最近详述的酯合成的一般方法，由相应的酸和（2,2,2-2H3）乙醇，（2H5）乙烷（2H）醇或（2H3）甲烷（2H）醇（均为Sigma Aldrich）制备【29】。（2H4）-11，（2H4）-51，（2H4）-16和（2H4）-21由丁-3-炔-1-醇，辛-3-炔-1-醇制备，和非3-炔-1-醇（均为Sigma Aldrich），分别使用从5-己炔-1-醇经由（2H4）己烷-1-醇14（2H4）合成（2H4）己醛的方法通过使（2H4）-8 【14】和乙烯基溴化镁[30]反应，然后使用Dess-Martin periodinane（Sigma-Aldrich）氧化得到的（2H4）辛-1-烯-3-醇，合成-18【31】。（2H3）-23和（2H6）-50通过Dess-Martin氧化分别由3 - [（2H3）甲基硫烷基]丙-1-醇32和2-（2H3）甲基（3,3,3-2H3）丙-1-醇（CDN同位素）制备【31】。（2H2）-26由非3-炔-1-醇（Sigma-Aldrich）通过氘铝锂（Sigma-Aldrich）氘化合成【33】使用Dess-Martin periodinane氧化得到的（2H2）非2-烯-1-醇【31】。（2H2） - 29使用公布的合成（2H2）-31【17】，的方法制备，但从3-丁烯-1-醇（西格玛奥德里奇）开始代替3-甲基-3 -丁烯-1-醇。

4 化学品和试剂

二氯甲烷，二乙醚和戊烷购自VWR（Darmstadt，Germany）。使用前，将它们通过装有拉西环的柱子（120 cm×5 cm）进行新鲜蒸馏。从VWR获得硅胶（0.040-0.63mm）并如先前详述的那样纯化【34】。从AffiGel 10（Bio-Rad，Munich，Germany）制备经过精制的琼脂糖凝胶【35】。

5 GC-O / FID系统

GC 8000系列（Fisons Instruments，Mainz，Germany）的气相色谱仪配备了冷柱式进样器，火焰离子化检测器（FID）和定制的嗅探口【36】。色谱柱为DB-FFAP，30 m×0.32 mm内径，0.25μm薄膜，或DB-5,30 m×0.32 mm内径，0.25μm薄膜（均为Agilent，Waldbronn，Germany）。载气为50 kPa（DB-FFAP）和40 kPa（DB-5）的氦气。注射量为1μL。将初始炉温保持40℃，保持2min，然后以6℃/min的梯度保持。将230℃（DB-FFAP）和240℃（DB-5）的最终温度保持5min。柱的末端连接到Y形玻璃分离器，其将柱流出物分成两个相等的部分。两个去活化的熔融石英毛细管（50cm×0.25mm ID）分别将流出物的一半输送到FID（基础温度250℃）和嗅探口（基础温度230℃）。

在GC-O运行期间，专门小组成员将他的鼻子放在嗅探口的上方，并评估流出物。每当检测到气味时，在记录仪绘制的FID色谱图中标记位置和气味质量。线性保留指数（RI）由气味剂的保留时间和相邻正构烷烃的保留时间通过线性插值计算得出【37】。

6 GC-MS系统

将配备有冷柱上注射器的HP 5890 Series II气相色谱仪（Hewlett-Packard，Heilbronn，Germany）连接到MAT 95扇形场质谱仪（Finnigan，Bremen，Germany）。载气为恒定流量为1.9 mL / min的氦气。该系统使用的色谱柱与GC-O / FID仪器中使用的色谱柱相同，并应用了相同的温度程序。质谱以电子电离（EI）模式在70eV和m/z 35-300的扫描范围内产生。通过使用Xcalibur软件（Thermo）完成数据分析。

7 Heart-Cut-GC-GC-MS系统

Trace气相色谱仪Ultra（Thermo）配备Combi PAL自动进样器（CTC Analytics，Zwingen，Switzerland），冷柱上进样器（Thermo）和GC柱，DB-FFAP毛细管，30 m×0.32 mm ID，0.25μm薄膜或DB-5毛细管，30 m×0.25 mm ID，1μm薄膜（均为Agilent）。使用100 kPa恒压的氦气作为载气。注射量为1-2μL。将初始烘箱温度保持在35-40℃，保持2-10 min，然后以6-40℃/min的梯度保持至230℃的最终温度。柱的末端连接到移动柱流切换（MCSS）系统（Thermo）。采用50 kPa的氦气作为补充气体，MCSS系统允许通过失活的熔融石英毛细管进行时间程序转移柱洗脱液（0。32 mm ID）同时与FID（Thermo）和用作监测检测器的嗅探口或安装在单独的气相色谱仪（CP 3800，Varian，Darmstadt）中的第二个GC色谱柱。第二个色谱柱的毛细管通过一个加热的（250°C）软管，连接两个气相色谱仪和第二个气相色谱仪烘箱内的液氮冷阱，可以重新聚焦Heart切割。第二维中的色谱柱为DB-1701,30 m×0.25 mm内径，0.25μm薄膜（Agilent），DB-5,30 m×0.25 mm内径，1μm薄膜（Agilent），BGB-174 E，30m×0.25mm ID，0.25μm膜（BGB Analytik，Rheinfelden，Germany），或DB-5,30m×0.25mm ID，0.25μm膜（Agilent）。第二炉的初始温度为30-40℃并保持2-10 min，然后以6-40℃/ min的梯度至最终温度200-230℃。第二维柱的末端连接到以EI模式或化学电离（CI）模式运行的Saturn 2200质谱仪（Varian）。对于CI，使用甲醇作为反应气。

在进行中心分析之前，通过使用监测检测器注射参比化合物后测定目标化合物在第一维中的保留时间。在随后的分析中洗脱目标化合物期间，将第一塔的流出物通过MCSS系统引导至第二维的塔中，并将转移的物质在预冷阱中冷冻聚焦。当MCSS系统切换回监测探测器时，关闭疏水阀冷却，并与质谱仪一起开始第二个气相色谱仪的温度程序。使用MS Workstation软件（Varian）完成数据分析。

8 GC  GC-MS系统

6890 Plus气相色谱仪（Agilent）配备了Combi PAL自动进样器（CTC Analytics），KAS4进样器（Gerstel，Mühlheim/ Ruhr，德国）和1GC柱DB-FFAP，25 m ×0.25 mm ID 0.25 μm 薄膜（Agilent）。使用2.0 mL / min恒定流量的氦气作为载气。柱的末端连接到第二柱，第二柱是DB-5毛细管，0.15 mm内径，0.30μm薄膜（Varian）。在第二柱开始时，使用液氮冷却的双级四喷射热调节器（Leco，Mönchengladbach，Germany）以不连续的部分（4s）收集从第一柱洗脱的挥发物，然后在第二柱的主要部分进行再色谱分离。该部件安装在位于主炉内的二级炉中。该柱的末端连接到Pegasus III飞行时间（TOF）质谱仪（Leco）的MS入口（250℃）。在EI模式下以70eV产生质谱，扫描范围为m/z 35-300，扫描速率为100 spectra/s。温度程序为40°C（2 min），然后是第一个炉的6°C / min至230°C（5 min），以及70°C（2 min），然后是6°C / min的梯度第二个炉250°C（5min）。对于数据分析，使用GC Image软件（GC Image，Lincoln，NE，USA）。

9 静态顶空GC系统

Trace GC Ultra气相色谱仪（Thermo）配备有Combi PAL自动进样器（CTC Analytics），冷柱上进样器（Thermo），液氮炉冷却和冷阱915（Thermo）。载气为110 kPa的氦气。将去祸害的熔融石英毛细管（0.2 m×0.53 mm ID（(Agilent））连接到进样器，通过冷阱，并以Y形玻璃分离器结束。分流器的一个出口通过另一块失活的熔融石英毛细管连接到电磁阀。另一个出口连接到DB-5毛细管，30 m×0.25 mm ID，1μm薄膜（Agilent）。该色谱柱的末端连接到另外两个串联的Y形玻璃分离器，它们将色谱柱流出物通过其他失活的熔融石英毛细管分成三部分，其中一部分（25％）被输送到FID（基础温度250°C），第二部分（25％）被导向嗅探口（基础温度230°C），第三部分（50％）转移到以EI或CI模式运行的Saturn 2100质谱仪（Varian）。对于CI，使用甲醇作为反应气。将初始炉温度保持0℃，保持2min，然后以6℃/min的梯度保持。在100℃下，梯度增加至40℃/ min。最终温度为230℃保持5min。

在注入顶空样品期间，将捕集器冷却至-150℃并打开电磁阀，允许升高的流量（20mL / min）。注射后，关闭电磁阀并将捕集器加热至250℃以将冷聚焦化合物转移至DB-5柱。如上详述的GC-O/FID分析进行流出物评估。

10 菠萝蜜挥发物的分离

将菠萝蜜果肉用液氮快速冷冻并使用实验室研磨机GM 200（Retsch，Haan，Germany）以4000 rpm（2×15s）研磨成粉末。在冰冷却下，将一部分粉末（100g）加入二氯甲烷（300 mL）中。分小份加入无水硫酸钠（250 g），同时使用由不锈钢制成的手动搅拌器连续均化混合物。在室温下磁力搅拌（1h）后，通过海砂和棉绒过滤匀浆。将残余物用二氯甲烷（3×100）洗涤将有机相合并。通过溶剂辅助的香料蒸发（SAFE）【38】在40℃下除去非挥发性物质。将SAFE馏出物浓缩至最终体积为1mL，首先使用Vigreux柱（50×1cm），然后使用Bemelmans微量蒸馏装置【39】。在分析之前，将菠萝蜜挥发性分离物储存在-20℃。

11 香气提取稀释分析（ADED）

使用DB-FFAP柱通过GC-O分析如上所述制备的菠萝蜜挥发性分离物（1mL）。由4名训练有素且经验丰富的GC-O嗅探器（3名女性，1名男性;年龄22-46）重复进行分析，直到结果可重复。将结果合并到共有GC-O色谱图中。然后，将菠萝蜜挥发性分离物用二氯甲烷逐步稀释1：2，得到初始溶液的1:2,1:4,1:8,1:16等的稀释液。稀释的样品也进行GC-O分析（3只嗅探器，2名女性，1名男性;年龄24-46岁）。最后，给每种气味物质指定味道稀释度（FD）因子，该因子代表最高稀释样品的稀释因子，其中三种小组成员中的任何一位在GC-O期间检测到气味物质。这种方法可以最好地补偿个体嗅探器的潜在特定性嗅觉和嗅觉减退。

12 菠萝蜜挥发物的分馏

如上所述制备菠萝蜜挥发性分离物（1mL）。为了除去所有二氯甲烷，加入己烷（1mL）并通过使用Bemelmans微量蒸馏装置【39】在52℃的水浴温度下将所得混合物浓缩至1mL的体积。将浓缩物施加到水冷（10℃）玻璃柱（1cm ID）内的纯化硅胶（8g）在戊烷中的浆液上。用100 + 0，90 + 10，70 + 30，50 + 50，0 + 100（v + v;各50mL）的戊烷/乙醚混合物进行洗脱。以50 mL份收集洗脱液，将各部分浓缩至1mL。另一种菠萝蜜挥发性分离物用于通过经过精制的琼脂糖凝胶选择性分离挥发性菠萝蜜硫醇【34】。

13 静态顶空稀释分析

将如上详述制备的菠萝蜜粉（5g）与磁力搅拌棒一起放入120 mL隔膜密封的玻璃小瓶中。在室温下连续搅拌1h的平衡时间后，通过使用气密注射器将一部分顶空（10mL）注入静态顶空GC系统。静态顶空GC-O分析由3个嗅探器（2名女性，1名男性;年龄24-46岁）进行，直到结果可重复。将结果合并到共有GC-O色谱图中。然后，将注入的顶空体积逐步减少两倍，得到约5，2.5，1.25，0.63，0.31和0.16 mL的体积。最后，每种气味物质分配FD因子，其表示初始进样体积（10mL）与最低进样体积的比率，其中三种小组成员中的任何一位在顶空GC-O期间检测到气味物质。

14 气味定量

对于化合物1-8，10-19，21-27，29-31，37-44，46-48和50-53的定量，将一部分低温冷却菠萝蜜果肉（0.5-50g）加入到溶剂中在冰冷却下（20-150 mL）。使用的溶剂是二氯甲烷（4-8，10-19，21-27，29-31，37-44，46-48）或二乙基乙醚（1-3，50-53）。稳定的同位素取代的气味物质（0.1-125 μg）溶解在溶剂中（10μL-3mL）作为内标（参见附加信息）。无水硫酸钠分小份加入（10-125 g），同时使用由不锈钢制成的手动搅拌器连续均化混合物。在室温下磁力搅拌（1h）后，通过海砂和棉绒过滤匀浆。用溶剂洗涤残余物，合并有机相。通过SAFE在40℃下除去非挥发性物质。将SAFE馏出物浓缩至0.2 μL至5mL的最终体积，并使用GCGC -TOFMS系统（47）或Heart-Cut-GC-GC-MS系统（1-8，10-19，21-27，29，30，31，37-44，46，48，50-53）进行分析浓缩物。

为了定量化合物49，将一部分低温冷冻菠萝蜜果肉（5g）与磁力搅拌棒一起放入120 mL隔膜密封的玻璃小瓶中。加入水（5mL）和（2H6）-49（1μg）的水（20 μL）溶液。在室温下连续搅拌1h的平衡时间后，将一部分顶空（1.2 mL）注入静态顶空GC系统。

使用特征量词离子从提取的离子色谱图获得对应于分析物和内标的峰面积。然后通过使用先前的校准线方程，由分析物峰的面积计数，标准峰的面积计数，所用的果肉量和标准添加量计算菠萝蜜果肉中每种目标化合物的浓度。通过分析五种不同浓度比（5:1，2:1，1:1，1:2和1:5）的分析物/标准混合物获得。附加信息中提供了单个量词离子和校准线方程。

15 气味阈值

根据美国材料与试验协会（ASTM）标准实践，通过强制选择递增浓度系列限制法测定气味和味道阈值，在纯水中正确地确定气味阈值【40】。受过训练的小组由慕尼黑工业大学莱布尼茨食品系统生物学研究所的15-20名员工组成。

16 香气重组

将等份（0.05 mL-2 mL）基准气味物质的水性或乙醇储备溶液合并，并用水定容至规定体积（10 mL）。将0.1mL混合物加入到接近菠萝蜜基质的水性缓冲液（100 g）中。缓冲液包括菠萝蜜中天然存在的浓度的葡萄糖，果糖，蔗糖，苹果酸，柠檬酸，琥珀酸和草酸【5】并通过加入氢氧化钾水溶液将其pH值调节至5.5的自然值。调节储备溶液的浓度和等分试样的体积以获得菠萝蜜果肉香味模型溶液中每种气味物质的最终浓度，其表示先前在菠萝蜜果肉中测定的浓度。香气模型溶液中的最终乙醇浓度低于1g / L，这是水中乙醇的气味阈值。

17 定量气味轮廓

将如上所述制备的新鲜均质的菠萝蜜果肉和菠萝蜜果肉香气模型溶液（35种OAVs≥1的化合物）的样品（10 g）置于具有盖子的圆柱形颈部玻璃杯（高度7cm，ID 3.5cm）中（VWR，达Darmstadt，德国）。12名受过训练的小组成员（9名女性，3名男性，年龄21-48岁）通过评定8个预定义描述的强度来评估两个样本的嗅觉曲线，评分范围为0到3，增量0.5，0 =不可检测，1 =弱，2 =中等，3 =强。各个描述符由溶解在水中的参比化合物的气味限定，其浓度高于其各自的气味阈值100倍。8个描述符和相应的参考化合物是“煮熟的马铃薯味”（3-（甲基硫烷基）丙醛），“麦芽味”（3-甲基丁-1-醇），“焦糖味”（4-羟基-2,5-二甲基呋喃-3（2H）- 酮），“奶酪味”（3-甲基丁酸），“果味”（3-甲基丁酸乙酯），“香蕉味”（3-甲基丁基乙酸酯） ），“煮熟的米饭味”（2-乙酰基-1-吡咯啉）和“肥皂味”（辛醛）。此外，小组成员要求评估模型溶液的总体嗅觉曲线与菠萝蜜果肉的总体嗅觉曲线的相似性，从0到3的等级，增量0.1，0 =没有相似性，1 =弱相似性，2 =清晰的相似性，让人想起菠萝蜜，3 =相同。通过计算算术平均值对所有小组成员的评级进行平均。小组成员要求评估模型溶液的整体嗅觉曲线与菠萝蜜果肉的总体嗅觉曲线的相似性，从0到3的等级为0.1增量，0 =没有相似性，1 =弱相似性，2 =清晰相似性，让人联想到菠萝蜜，3 =相同。通过计算算术平均值对所有小组成员的评级进行平均。

结果和讨论

1 通过AEDA进行气味筛选

通过溶剂萃取，SAFE和随后的浓缩从新鲜果肉制备菠萝蜜挥发性分离物。在蒸发溶剂后，在一条滤纸上正交评价提取物，馏出物和浓缩菠萝蜜挥发性分离物的嗅觉曲线。结果表明没有实质性变化：在分离程序的所有水平，菠萝蜜果肉的特征香气仍然清晰可见。

AEDA在菠萝蜜挥发性分离物中的应用揭示了48种气味物质，FD因子为1至≥8192（表1）。通过比较在AEDA期间检测到的气味物质的RI和气味描述与从文献中收集并在内部数据库中汇编的参考化合物的数据来实现初步结构指认。通过GC-O在两种不同极性分离系统（DB-FFAP和DB-5）上与菠萝蜜挥发性分离物平行分析适当稀释度的相应参考化合物，确认结果。基于菠萝蜜挥发性分离物和真实参考化合物中化合物的相同保留指数和气味特性，48种菠萝蜜中的39种（1-8，10-19，21-27，29-31，37-44,46-48）的结构可以指认。通过EI和CI模式中的GC-MS分析获得进一步的确认。为了避免共洗脱化合物的任何质谱干扰，通过硅胶色谱法将菠萝蜜挥发性分离物分级成五个不同极性的级分。在另一个实验中，通过经过精制的琼脂糖凝胶从菠萝蜜挥发性分离物中选择性地分离硫醇。通过GC-O分析各个级分以定位气味物质，然后与适当稀释的参考化合物样品平行进行GC-MS分析。出 使用这种方法，明确鉴定出31种菠萝蜜味道（2-8,10-17,21-24,29-31,37,39-44,47,48）。对于化合物1,18,19,25,26,27,38和46，质谱确认失败。对于化合物9,20,28,32,33,34,35,36和45，既没有通过比较保留指数和气味质量也没有通过质谱分析获得结构建议。因此这些化合物仍未知。

▼表1 从菠萝蜜果肉中获得的SAFE馏分中的气味物质

在FD因子≥8192时，菠萝蜜挥发性分离物中最有效的气味物质是水果味的3-甲基丁酸乙酯（6）和焦糖气味的4-羟基-2,5-二甲基呋喃3（2H）- 酮（42）。之前在菠萝蜜中发现了3-甲基丁酸乙酯【2-4,6-9】。与数据一致，AEDA在Gomes Fraga 【9】对菠萝蜜挥发性分离物的应用也显示出3-甲基丁酸乙酯作为具有最高FD因子的化合物。相比之下，尚未在菠萝蜜中鉴定出4-羟基-2,5-二甲基呋喃-3（2H）- 酮。然而，据报道，榴莲蜜是一种密切相关的物种【4,41】。对于未知的肉味的硫醇33，确定FD因子为2048。具有高FD因子的其他化合物包括3-甲基丁酸甲酯（3；果味，FD因子256），己醛（8；青香，草味，FD因子256），3 - 甲基丁酸（31；奶酪味，FD因子256），己酸（37;汗，FD因子256），丁酸乙酯（4;果味，FD因子128），两种色谱未分离的气味物质3-甲基丁-1-醇（ 13；麦芽香）和2-甲基丁-1-醇（14；麦芽香），FD因子为128，2-乙酰基-1-吡咯啉（19；煮熟的米饭味，FD因子128），3-（甲基硫烷基）丙醛（23；煮熟的马铃薯味，FD因子128）和乙基（2E）-3-苯基丙-2-烯酸酯（44；果味，FD因子128），所有这些都曾被报道为菠萝蜜挥发物。用FD因子1-64检测到另外35种气味物质。其中，（2E） - 壬-2-烯醛（26），（2E，6Z） - 壬-2,6-二烯醛（27），2-甲氧基苯酚（38），ɣ-八内酯（41），4-先前没有报道过甲基苯酚（43），3-羟基-4,5-二甲基呋喃-2（5H）- 酮（46）和香草醛（48）作为菠萝蜜挥发物。

2 静态顶空GC-O筛选高挥发性气味物质

AEDA的气味筛选不包括沸点低于萃取溶剂沸点的化合物，因为这些化合物在浓缩步骤中会丢失。因此，GC-O与静态顶空稀释分析相结合用作补充技术，以筛选高挥发性菠萝蜜果肉气味物质的组分。

结果显示另外五种气味物质（表2）。其中最有效的是具有麦芽为的2-甲基丁醛（52）和3-甲基丁醛（53），它们没有被所用的柱分开，因此提供了FD因子32的组合。其他化合物是2-甲基丙醛（50；麦芽，FD因子16），丁醛（51；麦芽，FD因子2）和二甲基硫醚（49；芦笋味，FD因子2）。到目前为止，尚未报道2-甲基丙醛和二甲基硫醚作为菠萝蜜挥发物。

▼表2 在菠萝蜜果肉上方的顶空中检测到其他气味物质

通过AEDA和静态顶空稀释分析进行的组合筛选产生了53种气味活性化合物，其中44种可鉴定，22种在菠萝蜜果肉中未报道。有56种气味物质，据报道有相似数量的气味活性化合物将AEDA施用于通过顶空清除-捕获方法获得的菠萝蜜挥发性分离物后的Gomes Fraga【9】。我们的研究结果证实了Gomes Fraga报道的3-甲基丁酸乙酯的出色气味效力，并且我们的AEDA中使用高FD因子检测到Gomes Fraga报告的主要菠萝蜜果肉气味的丁酸乙酯。然而，对于Gomes Fraga强调的其他两种气味剂物质，即3-丁基丁酸丁酯和丁酸丁酯，情况并非如此，这两种气味都不是本研究检测到的气味活性化合物。另一方面，在本研究研究中发现具有高FD因子的4-羟基-2,5-二甲基呋喃-3（2H）- 酮，但是Gomes Fraga没有报道。

3 气味定量和气味活性值计算

随后对通过AEDA鉴定为气味活性化合物的44种挥发物和静态顶空稀释分析进行定量。在43种化合物的定量中，使用目标分析物的稳定同位素取代的类似物（参见附加信息）作为内标，以完全补偿后处理过程中的损失。相反，通过（2H2）-3-甲基丁-1-醇作为内标，用3-甲基丁-1-醇同时定量2-甲基丁-1-醇。

定量结果（表3）显示浓度范围为0.0161 μg/ kg（3-异丁基-2-甲氧基吡嗪，25）至101000 μg/ kg（3-甲基丁酸，31）。在3-甲基丁酸旁边，还发现3-羟基丁-2-酮的高浓度（17; 44600 μg/ kg），乙酸（22; 9940 μg/ kg），3-甲基丁-1-醇（13; 5460μ g/ kg），4-羟基-2,5-二甲基呋喃-3（2H）-酮（42; 3090 μg/ kg），2-甲基丁-1-醇（14; 2190 μg/ kg），乙基3-甲基丁酸酯（6; 1710μg/ kg），己酸（37; 1560 μg/ kg），丁酸乙酯（4; 1370 μg/ kg），辛醛（16; 1130 μg/ kg）和丁酸（29; 1110μg/ kg）。

Ong等人（2008）发表了唯一研究关于菠萝蜜挥发物定量数据的文章【6】。使用顶空固相微萃取结合单一内标完成定量。从五个不同的栽培品种收集数据。Ong等报道了大部分浓度，低于本研究中的浓度。特别是己醛（22-33 μg/ kg），丁酸乙酯（107-127 μg/ kg）和3-甲基丁醛（119-176 μg/ kg）的浓度明显低于本研究测定的浓度（700 μg/ kg，1370 μg/ kg和759 μg/ kg）。Ong等人还报道了3-丁基丁酸乙酯（238-986μg/ kg），丁醛（109-159μg/ kg），3-甲基丁酸甲酯（132-388 μg/ kg），2-甲基丁醛（115 μg/ kg），3-甲基丁-1-醇（711-1753μg/ kg）和2-甲基丁-1-醇（469-906 μg/ kg）的浓度较低。与之相比，Ong等人发现乙酸3-甲基丁酯（499-8284μg/ kg），2-甲基丁酸乙酯（174μg/ kg）和乙酸丁酯（241-988μg/ kg）的浓度明显更高。据报道，只有359-721μg/ kg的丁烷-1-醇与本研究的数据集（478 μg/ kg）在相同的范围内。

为了评估单个菠萝蜜气味物质的气味效力，计算每种化合物的OAV，作为其在菠萝蜜果肉中的浓度与其在水中的鼻腔气味检测阈值的比率。对于35种气味物质，测定OAV> 1（表3），因此其在菠萝蜜果肉中的浓度超过其各自的阈值。OAV为74000，水果味3-甲基丁酸乙酯 （6）显示最高值。这符合AEDA的结果，其中6表现出最高的FD因子。还获得了用于进一步水果味的酯的高OAV，即丁酸乙酯（4; OAV 1800），3-甲基丁酸甲酯（3; OAV 280）和2-甲基丁酸乙酯（5; OAV 190）。对于一些具有麦芽味的醛类，如3-甲基丁醛（53; OAV 1500），2-甲基丙醛（50; OAV 1400），丁醛（51; OAV 550）和2-甲基丁醛（52; OAV 170），以及柑橘，肥皂味的辛醛（ 16; OAV 330），青香，草味的己醛（8; OAV 290），奶酪，汗臭的3-甲基丁酸（31; OAV 210），类似芦笋的二甲基硫醚（49; OAV 180），黄瓜般的气味（2E，6Z）- 2,6-二烯醛（27; OAV 110），和煮熟的米状味的2-乙酰基-1-吡咯啉（19; OAV 100）。另外21种化合物的OAV介于1.7和82之间。然而，9种气味物质的浓度，都低于其气味阈值。这些化合物认为与菠萝蜜果肉的总体香气无关。

4 香气重组

为了证明所有对菠萝蜜果肉的总体香气有贡献的化合物正确鉴定和定量，进行了香味重组实验。制备含有35种气味物质的水性香气模型溶液，其中已计算出OAV≥1（参见表3）。模型溶液中气味物质的浓度对应于先前在菠萝蜜果肉中测定的天然浓度（参见表3）。此外，模型溶液含有菠萝蜜浆中存在的主要糖和酸，并将其pH值调节至果肉的pH值。

▼表3 菠萝蜜果肉主要气味物质的浓度，气味阈值和OAV

通过使用训练有素的感官小组和8个可以在菠萝蜜果肉香气中感知的特征气味的描述符，在定量嗅觉分析中将香气模型溶液与新鲜菠萝蜜果肉进行正交比较。结果（图1）显示模型溶液的气味轮廓与新鲜菠萝蜜果肉的气味轮廓之间的良好一致性。整体相似性评为2.9分（满分3分）。这些特征是水果味，香蕉味，煮熟的米饭味，肥皂味，奶酪味，煮熟的马铃薯味，麦芽香味和焦糖状气味的平衡组合，其中水果味被评为略强于其他气味符。

▲图1 菠萝蜜果肉与菠萝蜜果肉香气模型溶液气味轮廓的比较

总之，本研究首次全面应用了最先进的方法，用于鉴定有助于菠萝蜜果肉香气的关键化合物。AEDA应用于从菠萝蜜浆中获得的挥发性分离物，其通过包括溶剂提取和溶剂辅助风味蒸发与静态顶空GC-O组合，用于补充检测高挥发性气味物质。周密的结构解析明确鉴定44种气味活性化合物。它们在菠萝蜜果肉中的天然浓度通过使用同位素取代的气味物质作为内标来确定，以补偿分析后处理过程中的任何损失并提供可靠的定量数据。已经确定其浓度超过其在水中的各自气味阈值的化合物成功地用于重组特征菠萝蜜果肉香气，提供了菠萝蜜果肉香气的关键化合物正确破译的最终证据。数据将为进一步研究提供基础，如研究不同菠萝蜜品种之间的香气差异，以及旨在阐明菠萝蜜加工过程中香气变化的分子机理研究。数据还可用于通过靶向育种帮助开发具有优异香气特性的新菠萝蜜品种。

学者简介

Martin Steinhaus

Martin Steinhaus，博士，1988-1995慕尼黑路德维希马克西米利安大学学习化学与食品化学；1995-1998德国Kurt-Hess谷物研究所研究科学家；1998-2000慕尼黑工业大学食品化学研究所研究科学家；2001年获食品化学博士学位；2000-2017德国食品化学研究中心高级研究员；自2012年起，慕尼黑工业大学食品化学讲师；2016-2017德国食品化学研究中心“Hedonic Value”小组负责人；2017年获食品化学教授；自2018年起，担任德国慕尼黑工业大学莱布尼茨食品系统生物学研究所“感官系统化学”部门负责人。主要研究方向：鉴定关键食品气味物质；热带水果，香草和香料中的主要气味；食品中的气味有机硫化合物及其分析；食品营养链中关键食品气味的变化；食品和非食品原料中异味的分子机理。

参考资料：

https://www.leibniz-lsb.de/en/institute/staff/profile-pd-dr-martin-steinhaus/

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