王明伟/Vogt/杨德华/水雯箐领衔中美科学家深度解析重要靶点PI3Kα的结构与功能

2022年9月13日（北京时间），由复旦大学王明伟、美国Scripps研究所Peter K. Vogt、中国科学院上海药物研究所杨德华和上海科技大学水雯箐领衔的合作团队于《美国国家科学院院刊》（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, PNAS）在线发表了题为“Nanobodies and chemical cross-links advance the structural and functional analysis of PI3Kα”的研究成果。该论文运用纳米抗体（Nanobody）和化学交联（Chemical cross-linking mass spectrometry, XL-MS）相结合的方法，揭示了特异性纳米抗体通过引起构象变化影响磷脂酰肌醇3激酶α（Phosphoinositide 3 kinase alpha, PI3Kα）催化活性的分子机制和柔性结构域BH、cSH2及SH3的位置信息，为深入认识这个关键信号分子的结构与功能提供了新的实验依据。

PI3Kα是一种重要的脂质激酶，由催化亚基p110α和调节亚基p85α共同组成异二聚体，与细胞生长和增殖密切相关，其功能获得性突变是肿瘤形成的驱动因素^1-2，因而成为治疗癌症的重要靶点。虽然PI3K抑制剂已被大量报道，但只有五种获准上市^3-4。PI3Kα蛋白具有高度的灵活性，其结构解析困难重重⁵，全长复合物中迄今仍有三个柔性结构域（BH、cSH2和SH3）的相对位置尚不明了，严重阻碍了相关新药的创制。

参加这项工作的科研人员首先对数十个PI3Kα特异性纳米抗体进行了筛选，从中选取3个高亲和力且稳定表达的抗体分子（Nb3-126、Nb3-142和Nb3-159），通过反复优化实验条件，获得了颗粒均一且性状稳定的全长PI3Kα分别与3种纳米抗体结合的蛋白复合物。借助中国科学院上海药物研究所300 kV冷冻电镜拍摄到的清晰图像和后继单颗粒三维重构，解析了整体分辨率分别为2.41、3.08和3.13 Å的立体结构。结果表明，对PI3Kα具有激活作用的Nb3-126使得催化核心具有高分辨率（图1A），但未能建模的p85α结构域密度则降低（图1B）。相反，抑制PI3Kα活性的Nb3-142使得催化核心的分辨率减弱，而未能建模结构域的密度却得以增强（图1C）。

图1. A，PI3Kα与Nb3-126复合物结构显示催化核心区域具有高分辨率。B，该复合物结构的局部分辨率图，显示未建模区域密度较低。C，PI3Kα与Nb3-142复合物结构显示其存在稳定的额外密度。

此外，在对酶活性无明显影响的Nb3-159与PI3Kα所形成复合物中的iSH2结构域发生显著移位（图2A）。三维可变性分析（3D variability analysis, 3DVA）发现了一种全新构象：iSH2和ABD位移超过10 Å并围绕其长轴旋转，nSH2结构域围绕p110α-E545-p85α-K379相互作用并略微旋转（图2B）；随后的建模和均方根偏差值（root mean square deviation, RMSD）研究显示出PI3Kα与Nb3-159复合物构象的广泛变化（图2C）。

图2. A，PI3Kα与Nb3-159复合物结构显示ABD和iSH2结构域发生了显著移位。B，3DVA表明从类似PI3Kα的结构（蓝色）向具有径向偏转ABD和iSH2结构域的结构（红色）之变化，其叠加显示了偏转程度和中心。C，以Cα计算的RMSD展示激酶结构域发生的改变。

研究团队进一步将PI3Kα与纳米抗体的复合物进行化学交联，应用XL-MS衍生的数据和HADDOCK软件将p85α未知结构域的晶体结构对接至冷冻电镜结构模型中来映射之前未能明确的额外密度区域（Extra density domains, Eds；图3）。结果显示，cSH2结构域始终位于PI3Kα活性位点的开口附近，并在该位置阻断与胞膜的结合；BH结构域位于C2、螺旋和iSH2结构域之下方；而SH3结构域的交联位点位于Y14和K15以及K80和K81之间，与p85α的BH、iSH2和nSH2结构域以及p110α的C2结构域相互作用。p85结构域之间的连接很长，是导致灵活性的主要因素，而这种灵活性可能是结合不同上游受体酪氨酸激酶所需构象之必备。

图3. A-C，PI3Kα与三种纳米抗体复合物的指向模型。cSH2结构域位于激酶结构域的前面，BH结构域位于激酶、iSH2和C2结构域的下方。

美国Scripps研究所Jonathan R. Hart博士、中国科学院上海药物研究所科研助理刘晓（现为复旦大学博士研究生）和上海科技大学潘琛博士为该论文的共同第一作者，复旦大学基础医学院王明伟讲座教授、美国科学院院士Peter K. Vogt教授、中国科学院上海药物研究所杨德华研究员和上海科技大学水雯箐研究员为共同通讯作者，合作者包括复旦大学基础医学院周庆同青年研究员和华中科技大学夏天教授等。该研究先后获得了国家自然科学基金委员会、国家科学技术部、国家卫生健康委员会、中国科学院‒诺和诺德研究基金和美国国立卫生研究院的经费资助。

原文链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2210769119

参考文献：

1. Burke JE, Perisic O, Masson GR, et al. Oncogenic mutations mimic and enhance dynamic events in the natural activation of phosphoinositide 3-kinase p110α (PIK3CA). Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2012, 109(38): 15259-15264.
2. Fruman DA, Chiu H, Hopkins BD, et al. The PI3K pathway in human disease. Cell, 2017, 170(4): 605-635.
3. Furet P, Guagnano V, Fairhurst RA, et al. Discovery of NVP-BYL719 a potent and selective phosphatidylinositol-3 kinase alpha inhibitor selected for clinical evaluation. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2013, 23(13): 3741-3748.
4. Krause G, Hassenrück F, Hallek M. Copanlisib for treatment of B-cell malignancies: the development of a PI3K inhibitor with considerable differences to idelalisib. Drug Design, Development and Therapy, 2018, 12: 2577.
5. Vanhaesebroeck B, Burke JE, Madsen RR. Precision targeting of mutant PI3Kα in cancer by selective degradation. Cancer Discovery, 2022, 12(1): 20-22.
6. Liu X, Yang S, Hart JR, et al. Cryo-EM structures of PI3Kα reveal conformational changes during inhibition and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2021, 118(45): e2109327118.

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