【PROTAC】新药开发系列（八）利用Cereblon降解BRD4

继前面的研究，Craig crews课题组又提供了一种新策略，通过利用E3连接酶Cereblon的PROTAC技术设计了有效的BRD₄降解剂。这为一类新的药物分子奠定了基础，这些药物分子主动募集E3连接酶以靶向特定的病理蛋白质进行降解，从而更广泛的利用许多“未成药”蛋白开发药物。

BRD₄及其抑制剂

BRD₄因其作为多种疾病环境中新靶点的巨大潜力而受到学术界和制药业的极大关注，特别是在癌症方面。BRD₄作为肿瘤学靶标的一个关键优势是它被鉴定为优先聚集在超增强子区域以控制关键癌基因如c-myc，bcl-xl和pax5，提供了一种替代策略，用于靶向那些难以通过传统策略抑制的癌蛋白。此外，BRD₄在特定致癌基因附近的基因组位点的独特高占据率提供了治疗窗口的潜力，其可以允许特异性靶向肿瘤细胞，同时保留正常组织。实际上，BRD₄抑制剂在不同的小鼠肿瘤模型中显示出具有良好耐受性的抗肿瘤活性。并且，对BRD₄抑制剂（如JQ1）的高度敏感性与不同肿瘤类型中c-MYC或n-MYC的高水平相关，包括c-MYC驱动的BL。目前，四种BETBromodomain抑制剂正处于I期临床试验中，主要集中在中线癌和血液系统恶性肿瘤（CPI-0610，NCT01949883；GSK525762，NCT01587703；OTX015，NCT01713582；TEN-010，NCT01987362）。但，研究者发现BRD₄抑制剂JQ1和OTX015可在所有测试的BL细胞系中快速而稳健地累积BRD₄蛋白。Shimamura等人在一组肺癌和前列腺癌细胞系中发现了类似的观察结果。一种可能的解释是抑制剂与BRD₄的结合导致构象变化，这导致蛋白质的热力学稳定性增加。类似地，抑制剂结合可能阻碍BRD₄对内源性细胞降解机制的可及性，从而使其在动力学上稳定。或者，BRD₄抑制剂可能会中断调节BRD₄蛋白水平的BRD₄介导的负反馈环。BRD₄水平的这种显着增加以及抑制剂结合的可逆性质可以阻止有效的BRD₄抑制。事实上，临床前和临床研究都表明，BRD₄抑制剂的作用主要是细胞抑制作用，细胞凋亡仅限于少数细胞系和I期患者的肿瘤。这可能会显着限制患者在临床可达到的BRD₄抑制剂浓度下的潜在受益。实现更有效的BRD₄抑制的一种策略是设计不可逆/共价抑制剂，它们可以在较低的药物浓度下实现期望的药理学效果。然而，共价抑制剂具有其自身的局限性，最显着的是蛋白质结合物的潜在免疫原性和高选择性障碍。

小分子抑制剂，通过抑制酶活性（如激酶抑制剂）或干扰蛋白-蛋白相互作用（如BRD₄抑制剂），已成为肿瘤学药物开发的大方向。然而，鉴于大多数小分子抑制剂的可逆结合，通常需要较大的全身药物浓度和持续暴露以确保足够的功能抑制。在许多情况下，维持体内足够高的药物浓度具有挑战性的。作为替代方案，通过RNAi或小分子诱导的蛋白质降解来消除引起疾病的异常蛋白质的方法正在发展为针对“未成药”靶点的新策略。于是，研究者开发了一种诱导蛋白质降解策略，利用蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC），将靶向蛋白质募集到E3泛素连接酶VHL（VonHippel-Lindau）进行泛素化标记和随后的蛋白酶体介导的降解。

降解BRD₄的PROTAC分子优势

图1 小分子BRD₄抑制剂导致显着的BRD₄积累和低效的c-MYC抑制

研究者设计了一种新型PROTAC分子（ARV-825），它一段连接临床批准的IMiD治疗药物pomalidomide利用E3连接酶Cereblon起作用，另一端使用BRD₄的蛋白抑制剂，使其快速降解BRD₄。该方法可做为靶向BRD₄药物开发的另一种新策略。他们首次证明了E3连接酶Cereblon在PROTAC技术范例中的应用，成功地通过ARV-825实现了BRD₄快速和显着的降解，从而导致强大且持久的下游c-MYC抑制。最重要的是，与高浓度的JQ1和OTX015相比，ARV-825导致更显着的增殖抑制和强烈的细胞凋亡诱导。BRD₄降解剂相对于抑制剂改善的功能效应可部分归因于对BL中驱动蛋白c-MYC的更完全和持续的抑制。BRD₄也可能具有支架功能，因为它是具有许多结合配偶的大蛋白质，其中许多仍有待鉴定和阐明。可以理解的是，消除BRD₄会产生比仅仅抑制其与含乙酰赖氨酸的伴侣结合的更深远的影响。BRD₄敲除（例如通过CRISPR或shRNA）的表型与抑制剂对BRD₄抑制的表型的比较将有助于提供这种可能性。

图2 利用E3泛素连接酶Cereblon以设计PROTAC以有效降解BRD₄

此外，为了进一步证实ARV-825的降解机制是通过Cereblon，研究者通过甲基化哌啶二酮片段中的NH基团制备了ARV-825的类似物。由于该NH基团在与Cereblon的His380的结合中是至关重要的，因此推测N-甲基化后会导致Cereblon结合亲和力的显着丧失。后续试验证明，正如预期的那样，N-甲基化的ARV-825不会降解BRD₄。Cereblon是普遍表达的蛋白质，因此当附着不同的靶蛋白质募集配体时，该方法可潜在地应用于各种器官/组织中的多种疾病治疗。有人已经提出将Cereblon下调作为多发性骨髓瘤中IMiD抗性的机制。在这种情况下，具有已知结合分子的备选E3连接酶可用于设计PROTAC疗法。

图3 ARV-825比小分子抑制剂具有更显着和更持久的c-MYC抑制

OTX015和泊马度胺与它们各自的靶标BRD₄和Cereblon的结合亲和力分别为10nM和3μM。令人兴奋的是，基于这两种配体的ARV-825在低于1nM时达到BRD₄ 的DC₅₀，这有力地表明作用于BRD₄的PROTAC能够参与蛋白质降解的多个循环，并且开发了由靶配体组成的功能性降解物的方法。所述靶配体虽具有较低的亲和力，但可提供功能效应。因此，许多缺乏酶活性位点但可被小口袋中的小分子结合的靶标可能变成具有PROTAC介导的降解的“可药物”。

图4 ARV-825比BRD₄抑制剂对BL细胞增殖抑制具有更好的效果

PROTAC等蛋白降解或屏蔽方法的不足

PROTAC或其它方式对BRD₄功能的更完全和更持久的破坏将有益于患者，因为其更有效的靶向和更少的给药方案。但它也可能与更严重的副作用相关，因为BRD₄以细胞背景依赖的方式调节多种生物过程。使用诱导型和可逆转基因BRD₄靶向RNAi小鼠模型的最新发现阐明了有效和持续的BRD₄靶向的潜在局限性，包括表皮增生，脱发和小肠中的细胞多样性和干细胞减少。这代表了药物开发中常见的两难问题，即确定是否以及如何在临床中实现最佳治疗指数。可喜的是，这些Brd₄抑制的靶向副作用似乎是可逆的，可以设置一个治疗窗口来更好地管理BRD₄靶向治疗。

图5 ARV-825比小分子抑制剂对BL细胞凋亡诱导具有更好的效果

由于BET家族BD1和BD2结构域的高度同源性，目前临床开发中的BET抑制剂（包括OTX015）在结合和抑制BRD2/3/4/T（BRDT仅在睾丸中表达）方面没有选择性。我们还检查了ARV-825对BRD2和BRD3的作用。由于OTX015对所有BET家族成员的相似亲和力，以及所有BET成员上的大量重叠表面赖氨酸，BRD2/3/4都可被ARV-825降解。然而，通过仔细设计可以增加/降低对各种结合靶标的亲和力的“接头”区域，PROTAC可以提供更多的机会来实现更好的选择性，或者可以定位其E3连接酶部分以获得特定靶标的最佳表面赖氨酸泛素化。这些假设需要通过建模和实验测试进行广泛的调查。如果属实，PROTACs作为一类新的药物分子，可以使未来多个疾病领域的患者受益匪浅。

参考文献

Doi: 10.1016 / j.chembiol.2015.05.009

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