AAV等基因治疗产品开发所面临的难题
基因疗法不仅可以治疗多种遗传病，还可以治疗非遗传性疾病。目前基因治疗使用最多的是人工改造后的病毒（如常用的AAV载体）作为治疗性基因的载体，将治疗性基因或小的核酸片段递送到患者体内相应器官或组织细胞内，如图1所示。作为最先进的疾病疗法，已有多种基因疗法获批上市，其中包括数种遗传病基因疗法和癌症基因疗法等。随着成百上千种基因治疗临床项目的快速推进，未来几年会有越来越多的基因疗法被推向市场。为了跟上临床研究的快速发展，研发人员正在努力简化及标准化基因治疗产品的制造及质量控制（QC）流程，以提高基因治疗产品质量并降低基因治疗药物制造成本。
研发人员使用多种分析手段来检测基因治疗产品及优化其制造流程，遇到异常结果时，需要研发人员给出合理的解释：生产过程中产生了不良制品？还是检测方法不可靠？亦或其他原因。具有专业检测人员及相关经验的检测分析机构经常会同基因治疗研发单位的研发人员合作加强检测方法及其分析的可靠性或合规性。
1. 衣壳空载
研发人员面临的主要挑战源自AAV载体本身（如图2所示），例如空的AAV衣壳，基因治疗产品纯化过程中必须将其最小化，因为这些病毒衣壳不包含DNA，当将它们输注给患者时，它们没有任何治疗益处，还有可能引起致命的副反应，例如免疫毒性。对于包含治疗基因部分拷贝的衣壳也是如此，这可能是由于在生产过程中病毒包装不完全引起的。
此外，空衣壳或包装不完全的衣壳可与完整衣壳竞争以感染患者的细胞。给药剂量中非活性病毒的衣壳的量越大，患者为达到治疗效果所需的药物总剂量就越高。给药剂量越高，发生严重副反应的风险越高。
这些杂质是如何产生的？由于AAV衣壳由60个衣壳蛋白组装而成，具有确定的形状结构。但组成AAV衣壳构建模块的三种蛋白在细胞内的比例可能会因影响而致波动较大，而且特定的衣壳蛋白的翻译后修饰可能会有所差异。这些复杂性促进了形成缺陷病毒的概率。在微观层面即分子水平上，这些杂质与理想的活性AAV非常相似，给工艺下游的纯化去除造成了一定的难度。因此，最好在上游的病毒包装制备工程中尽量降低无活性病毒的比例，一方面提高了病毒的产量或质量，一方面降低下游纯化的压力。
目前有多种方法可以测量空壳/全病毒比例（the empty/full capsid ratio），当开发人员建立CMC时（CMC全称为Chemical Manufacturing and Control，包括生产工艺、杂质研究、质量研究及稳定性研究等，即药学研究部分。药学研究资料，是药品申报资料中非常重要的部分。），选择一种优化方法非常重要，因为他们必须使用该方法进行有效的质量控制，以判断产品是否符合放行标准及评估不同批次产品间的稳定。
其中一种方法是通过透射电镜（TEM）来确定空壳/全病毒比例。这种方法较为经典，但偶尔由于染色过程的差异，可能导致一定误判。有研发人员是用酶联免疫吸附法测定病毒总颗粒，用QPC R法测定病毒总基因组，因此可以计算出空壳/全病毒比例，但由于QPCR滴度可能有很大的变化，因此空壳/全病毒比例通常不是很可靠。还有一种方法采用分析超速离心法，在不同密度下分离出空壳和全病毒，并根据总蛋白含量计算其比例。此外，最近，报道有研究人员采用SEC法（size-exclusion chromatography）或Qubit 荧光定量（Qubit Fluorometric Quantification kit）方法定量AAV空壳/全病毒比例，这两种方法样本用量较分析超速离心法少很多，且可以高通量操作，据报道SEC法与Qubit 荧光定量检测精确度相近，但Qubit 荧光定量显然在试剂等成本考虑方面更具优势，且无需大型设备仪器。
2. 衣壳分子指纹
病毒衣壳蛋白需要由正确的蛋白序列制成，并且它们通常需要加上特定的翻译后基团才能在细胞中充分发挥活性。这方面质量控制，可通过肽图分析方法进行检测。通过液相色谱与串联质谱联用（LC-MS / MS）可完成相关肽图分析，它可绘制出AAV颗粒在细胞中发挥正常功能所需的主要蛋白质序列和翻译后修饰。
除了可用于自身蛋白序列质量检测外，还可以用以检测衣壳产量、杂质含量等，这些数据可以与生产工艺参数的改变联系起来以优化生产工艺。
3. 病毒活性与制品杂质
必须对基因治疗病毒载体转导细胞的能力或活性进行检测，此外还得测试制品杂质对细胞是否具有毒性。
通过载体转导细胞后，表达产物引起的细胞表型或功能变化来评估产品的活性或效能。开发这些检测方法得“具体问题具体分析”，因为没有一种“放之四海而皆准”的检测方法供开发人员使用，例如有的可以通过定量表达产物的活性来测试转导效率或病毒活性，不同的基因的产物活性检测方法不同；有的产品因检测其产物活性存在困难而只能通过检测产物物理含量来测试其转导效率或产物表达量，例如通过westernblot、流式细胞术、ELISA等。
此外，基因治疗产品需经过检测确保其杂质残留量低至规定标准，以确保安全。基因治疗制品杂质主要包括工艺相关杂质、制品相关杂质以及外源污染物。应尽可能地对杂质进行分析鉴定，并采用适宜的方法评估其对生物学活性和安全性的影响。
4. 产品成本
由于基因治疗是一个新兴领域，因此对于提高基因治疗CMC效率的指导方针还未得到足够的完善，行业内相关的研发人员急需更加完善的指导性文件，这需要包括研发人员在内的相关人员的共同努力。目前人们正在努力标准化过程，以便更好地比较载体的质量，希望最终建立通用的剂量单位。目前急需要开发出更强大的分析测定方法，以确保基因疗法开发和随后输注给患者时质量控制的一致性。
此外，由于该技术的新颖性，用于分析评估基因疗法质量的行业标准也在不断变化。直到2020年1月，FDA才为相关研发人员发布了七项新指南，值得注意的是，早期的基因疗法参与者视此指南为最低要求，目前他们在开发基因疗法时正在努力使产品达到更高的质量标准，并乐于分享关键发现以制定未来的行业标准。监管机构对审查基因疗法越来越熟悉，其商业化之路将走得更快。不可否认，基因疗法将为患者带来不可思议的收益，但是对于提高生产效率和降低成本，使基因疗法更容易且更广的惠及患者，至关重要。
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