基因治疗从临床走向商业化的关键：AAV生产工艺的放大

AAV基因疗法作为基因治疗领域目前管线数量最多、最具实力的赛道之一，行业与市场热度持续高涨。近年来随着基因治疗临床试验的大量开展、基因治疗产品的陆续预期上市，越来越多的政府红利更是极大地鼓舞了行业发展。据统计，2021年仅国内基因治疗领域的融资事件就有22起，融资总金额达31亿元，预计至2025年国内基因治疗市场规模将达178.9亿元。 

尽管如此，整个CGT赛道还是处于新兴阶段，目前FDA仅批准3款AAV基因治疗产品上市；就国内而言，去年第一款AAV基因疗法进入临床。近期AAV基因疗法在我国发展迅猛，已有多款AAV基因治疗产品获批IND，如朗信生物的LX101、天泽云泰的VGB-R04、弘基生物的KH631以及嘉因生物的EXG001-307。虽然整条上市转化的道路已得到成功验证，但对于众多还处于临床早期甚至临床前阶段的Biotech们来说，如何对产品的生产工艺进行放大升级，从而实现从“小规模的实验室生产”到“满足大量临床需求的规模化生产”的转变是必须面临的最大挑战之一。

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工艺放大的背后，是质量与成本的考量

AAV产品的规模化生产一直是影响其大规模应用的瓶颈，也是导致AAV产品价格高昂的主要原因之一。首个上市的AAV基因疗法Glybera平均一次治疗的费用高达100万美元，其中病毒载体的生产成本就占据了总价的40%，其撤市是基因疗法第一次商业化的铩羽而归。因此对AAV生产工艺进行放大升级，不仅是为了满足使用量的需求，更是出于对产品质量与成本控制的选择。

从实验室制备到规模化生产，并不是简单的线性增量。实验室生产中常用的生产工艺，如上游的贴壁培养体系与下游纯化的超速离心技术，都很难在规模化生产中应用。然而，事实上，这些难以扩展的生产工艺往往一直持续应用到1期临床阶段。一旦1期试验成功，研发者将面临两个严峻的挑战：一是如何转向可扩展的新工艺；二是如何在生产工艺变更前后，确保产品的一致性。

生产工艺的可扩展性、产品的可重现性与可比性，都关乎着基因药物的安全性和有效性，更是关乎药物的成本。

另外，生产原料的供应也是阻碍大规模生产的一个重要影响因素。不仅需要长期稳定且充足的供应，同时对原料质量的一致性存在较高要求。并且随着生产工艺的转换，原料的质量等级也需要迭代升级。在这方面，专业从事AAV载体开发与制造的CDMO企业就具备明显优势。比如宜明细胞就自己出品了一系列关键原料，如稳定高产的细胞系与高发酵产量的GMP质粒。

在成本方面，规模化生产无疑是降低成本的有效手段。作为遗传类疾病的基因治疗载体来说，AAV的用量是非常巨大的，即便是低剂量的临床试验也会达到1×1012 vg/kg，高剂量的临床试验甚至会高达5×1013 vg/kg。如果能将细胞系产能提高2～3倍，那么最终的产品滴度就可以相应地提高2～3倍。产能翻倍最终可以降低产品价格，实现减半甚或是降至原来的1/5～1/10，所以上游的放大生产工艺尤为重要。

除了生产工艺的开发，生产设备的更新、高端人才培养、人力资源管理以及基地建设都是在规模化生产中的成本挑战。尤其是基地建设，随着全球多中心临床试验需求明显增加，以及国内试验对工厂地理位置的地区覆盖性亦存在要求，在多地区建立基地也成为CDMO企业必备的条件。宜明细胞不仅在济南建有面积达5000㎡ 、洁净度达到C+A标准的GMP厂房，近期在苏州又建立了面积约9000㎡ 的整栋独立GMP生产平台，在北美（加拿大温哥华、美国马里兰）建有研发中心。相较于B+A厂房，C+A厂房的整个运营成本也会大大降低，在保证GMP病毒质量符合国家法规要求的同时，提高患者群体的可及性。

可以看出，在大规模AAV生产中，拥有放大工艺成功经验的CDMO合作伙伴将助力药物研发公司将研发项目转化到临床应用并推向商业化市场。

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生产工艺的开发：AAV生产降本增效的基石

AAV载体规模化生产的基石是具有优化生产能力的上下游工艺。

• 上游生产工艺（UPS）：主要包括质粒制备，细胞培养、转染与病毒载体生产；

• 下游生产工艺（DPS）：主要包括细胞裂解与澄清，病毒载体纯化（捕获纯化、精细纯化、超滤浓缩等），配方/罐装，质量检测。

通过上游工艺获得高产量的病毒载体，通过下游工艺去除空的衣壳病毒颗粒、提高AAV载体纯度是整个生产流程中目前最为关键的挑战。

上游——稳定高产的细胞系培养体系

正如前文中提到的，细胞系产能提高可以大幅降低成本。同时，上游病毒生产工艺的选择也会带来不同的杂质组成和比例，从而直接影响下游纯化压力。基于QbD（质量源于设计）的原则，若想在下游纯化工艺也尽可能降本提效，就必须提升上游病毒制备工艺的产量与产率。

无血清条件下的放量一直以来是AAV商业化生产的一大瓶颈，因此，从源头开发稳定的、适用于放大工艺的、高质量的细胞系就成为AAV工艺开发的重点之一。目前市面上主要的AAV包装系统有HEK293三质粒共转染系统、昆虫细胞杆状病毒包装系统(Baculovirus Expression Vector System，BEVS)和包装细胞系体系(Packaging Cell Lines，PCL)。这三类病毒载体生产所需的细胞系不同，其优势和挑战也有所不同。

其中HEK293三质粒转染系统在目前的使用最为常见，其适用于所有血清型的临床或商业产品，并已获得了监管机构的普遍认可。

这种病毒包装系统的生产周期较短而且相对灵活，可用于生产多种AAV亚型。但该方法的缺点也很明显：1. 贴壁培养数量受限于反应器容量和形状，工艺难以放大，产量低；2. 质粒原料的成本较高；3. 手动操作介入次数多，产品的一致性挑战较高。

目前悬浮培养工艺已经逐渐开始替代贴壁培养，成为下一代三质粒转染包装系统规模化生产的解决方案，提供更高的整体产量和更优的可放大性。但是市场上的悬浮细胞系由于易聚集性和转染效率低等问题使得病毒产能低，高产稳定的悬浮293细胞株长期缺乏。宜明细胞自主研发了AAV包装系统，可以根据客户的需求，采用悬浮和贴壁两种不同的工艺进行病毒包装，其中包括具有完全自主知识产权的悬浮293XS细胞系、高品质GMP质粒以及优化的转染条件。悬浮293XS细胞系可无血清悬浮培养，培养规模可放大到200L-500L-2000L，细胞培养密度可达1X107cells/ml（下图），病毒产量高达1X1014vg/L。GMP质粒的发酵产量>1g/L，发酵规模可达200L。

▲驯化的293悬浮细胞 (数据来自宜明细胞)

下游——病毒载体纯化技术

随着上游生产工艺的放大，在一致水平的前提下保证AAV产品的安全性和有效剂量变得更加具有挑战性，对于AAV的特定质量属性的监控与检测就尤显重要。

上游细胞转染扩增后，病毒经过细胞裂解被释放出来。以HEK293三质粒转染的制备为例，待纯化的反应液中将包含着宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白、细胞碎片、AAV空壳、支原体、AAV聚集体、核酸酶、辅助病毒等杂质，按照来源可分为工艺相关杂质、产品相关杂质和外来物质，这些杂质会引起安全性问题，需要将其残留率控制在限度范围之内。

一个典型的可放大的AAV纯化平台主要包括以下步骤：收获和澄清；捕获纯化；精细纯化；病毒去除和超滤浓缩。

➤ 澄清步骤：主要通过膜过滤法去除蛋白类杂质；

➤ 捕获纯化步骤：通过AAV衣壳的不同理化性质选择合适的层析填料，捕捉目标病毒载体。亲和层析、离子交换层析和疏水层析等柱层析较为常见，目前单步亲和层析已被证明可以达到相对高的纯度，但无法进一步降低杂质，同时无法有效分离空衣壳和完整病毒颗粒，因此额外的层析步骤必不可少；

➤ 精细纯化步骤：分离工艺相关杂质和产品相关杂质的重要环节。主要纯化手段以各类层析法为主，阴离子交换层析法(AEC)目前使用较多。作为膜层析法的一种，该方法去除杂质的速率远大于柱层析法，且不受填料孔结构扩散力的限制，降低了层析填料和缓冲液成本。其工艺放大的规模相对较灵活，可以同时兼顾实验室生产和规模化生产，适用于DNA、蛋白质和病毒等多种杂质的去除。

这一步骤主要针对AAV空衣壳的去除，具体包括密度梯度离心法、连续流超速离心法、离子交换层析法、毛细管电泳法等。传统方法是密度梯度离心法，使用氯化铯或碘克沙醇。该方法目前可以应用于IND申请规模的AAV生产，但难以达到更大规模的GMP级要求。连续流超速离心法则尚无稳定的分离能力结论，而离子交换层析法依赖空衣壳和正常衣壳的微小电荷差异，因此存在放大的挑战。

由于AAV衣壳亚型的理化性质各有不同，每一种血清亚型都需要特定的纯化方法，很难开发出适用于所有AAV亚型的层析方法。宜明细胞创新开发了“两步层析法”，高效简化下游层析的多个步骤降低成本，并可有效解决空壳率、病毒感染滴度、宿主蛋白、病毒颗粒的聚集度等问题。

第一步AC层析：可以强有力地去除宿主蛋白残留、宿主DNA残留、质粒残留。其中宿主蛋白残留以及Benzonase核酸酶残留低于检测线，宿主DNA残留以及质粒残留的去除能力都大于5log。

▲AC层析捕获AAV（数据源自宜明细胞）

第二步AEC层析：配合切向流等工艺进一步纯化去除大多数的空壳AAV。去除空壳之后，AAV病毒空壳率可以从90%下降到30%以下。

▲AEC层析纯化后 （数据源自宜明细胞）

经过“两步层析法”后，TEM图像显示AAV空壳率可达到10%。

▲图像数据来自宜明细胞

综上，AAV基因治疗产品从临床走向商业化，必须实现“规模化生产”，而在规模化生产中如何“降本增效”则高度依赖于上下游关键生产工艺的持续放大与优化升级。

总结

对于药企而言，能够同时拥有AAV开发、生产和检测的集大成者少之又少，因此大多数公司更青睐于采取一种内部生产与外包生产相结合的方式。这种混合方式在操作上更加灵活，将风险分散，也可以让药企将精力更加聚焦在管线研发上。

在后疫情时代，CAR-T、AAV和mRNA等CGT热门疗法的研发到生产全流程都自然而然逐渐趋于本土化、国产化。伴随产业化的步伐，国内CDMO企业已经助力前沿产品进行阶段性转化突破。2022年1月下旬，朗昇生物的LX101和天泽云泰的VGB-R04接连获得IND受理，宜明细胞作为CDMO合作伙伴，在这两个项目中，提供了CDMO全程服务，包括菌种库构建、GMP质粒开发生产、GMP AAV开发生产、方法学开发检测以及稳定性研究等。

近年来，宜明细胞分别在济南、苏州基地建立了GMP厂房，采用绝对A级隔离器生产、灌装，并邀请了知名专家进行GMP体系建设，按照法规要求建有独立的质粒生产平台、病毒包装平台、细胞培养平台、细胞库平台，以及涵盖生化、微生物、化学的质量检测平台。

其中今年正式投入使用的苏州生产研发基地进一步扩大了宜明细胞高品质CDMO平台的能力和规模，苏州基地拥有符合国际一流标准的cGMP生产线数十条，原核发酵规模为10L-50L-200L，真核细胞培养规模为50L-200L-500L-2000L，并且按照新版GMP附录《生物制品规范要求》，将宜明5大平台合规合理地进行划分，最大限度地降低风险和相关成本。目前宜明细胞可向CGT企业提供GMP级别的AAV、质粒、慢病毒、腺病毒、CAR-T等病毒载体与基因药物开发、制备服务，并配套提供产品工艺开发方案、GMP体系平移等服务，全方位为CGT领域客户提供一站式CDMO整体解决方案，以协助客户加速基因细胞药物在中美欧等国的研发、临床试验和上市。

为促进CGT产业的发展及尽最大可能服务CGT新药研发公司，最终惠及患者，宜明细胞联合医麦客，将于2022年7月15日举办2022年CGT“宜起创未来”高峰论坛暨宜明细胞苏州GMP商业化基地开业仪式。本次会议将邀请国内外一线细胞与基因治疗行业和临床专家，瞄准基因治疗的最新研究动态和进展，针对基因治疗的临床监管、治疗规范、细胞治疗安全性等业内关切的问题，进行充分探讨。

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