类病毒载体---新一代基因药物递送平台

基因治疗载体一般可分为病毒性载体和非病毒性载体两大类。根据Cortellis数据库资料显示，截止2022年全球共有1562个基因治疗药物上市或在临床研究阶段；其中以腺病毒相关病毒（AAV）为载体进行的基因递送药物研究超过800项（图一）。用于基因治疗的重组腺相关病毒载体（rAAV）是在非致病的野生型 AAV基础上经多轮生物工程改造形成的，具有如下4个特点：（1）较高的生物安全级别：rAAV是缺陷型病毒载体，目前尚未发现rAAV能够导致人类疾病；（2）较强的基因转导能力：rAAV对分裂/非分裂细胞均有较高的转导效率，实现其携带基因的表达；（3）独特的组织特异性：不同血清型rAAV能够对不同组织进行特异性转导，实现精准的体内表达；（4）持久的表达潜能：rAAV能够长期稳定存在于宿主细胞中，具有持久的表达潜力。然而在以CRISPR为基础的基因治疗中，运用AAV病毒进行体内递送存在一些明显劣势，例如AAV病毒的包装容量约4.7kb，当插入的DNA长度接近4.7Kb时，包装效率会显著降低，这导致AAV无法通过单一载体形式对碱基序列较长的碱基编辑器和先导编辑器等进行包装；AAV病毒在体内表达时间较长，更易引发Cas9蛋白的脱靶效应；另外，AAV病毒可少量地整合到宿主基因组DNA中，有利的方面是可以增加疗效的持久性，不利的方面是理论上有导致肿瘤发生的可能性存在（但实际情况来看，其概率很低），目前的大量临床试验还未见此副作用的报道^1,2。

基于上述原因，在实际临床应用中，更偏向于将Cas9以mRNA或蛋白的形式瞬时递送到人体中。因此，以非病毒的纳米颗粒为载体的递送方式也被应用到临床中，例如Intellia Therapeutics公司2021年公布用于治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR）的NTLA-2001 疗法，就是通过脂质纳米颗粒（LNP）载体，将携带靶向致病基因 TTR的 sgRNA 和优化的 SpCas9 蛋白的 mRNA 序列，递送至肝脏³。由于LNP是通过内吞途径进入细胞，且不易从内吞体逃逸出来，因此LNP递送效率低于AAV载体。金纳米颗粒与内吞体破坏聚合物的复合物具有逃逸内吞体的能力，并已用于将CRISPR RNP递送到人血液祖细胞以及小鼠肌肉和大脑；然而，这种类型的纳米材料可以在肝脏和脾脏中积累两个多月，并显著改变几个途径的基因表达模式^4-7。由于AAV和纳米颗粒为载体的基因治疗策略各有优缺点，开发新型的基因递送方式已成为近年来的热点研究方向，病毒样颗粒 (VLP) 是一种可以感染细胞但缺乏病毒遗传物质的病毒蛋白组装体，VLP可以递送mRNA、蛋白质或者核糖核蛋白（RNP）。VLP来源于病毒支架，可利用病毒特性实现有效的细胞内递送，具有封装药物、内涵体逃逸的功能，经设计可靶向不同的细胞类型。本文将着重介绍类病毒载体（VLP）的研究进展及应用潜力。

图一、在研的基因治疗药物统计

目前报道的用于递送mRNA或蛋白的VLP都是基于逆转录病毒，由于未成熟的逆转录病毒颗粒缺乏刚性对称结构，因此可提高封装药物的灵活性。此外，逆转录病毒直径约为100-200 nm，可为装载mRNA或蛋白提供充分的空间。最后，逆转录病毒还可通过调节其包膜蛋白的组成实现细胞靶向性递送。逆转录病毒含有两份线性单链RNA，编码Gag, pol和env基因。Gag包含组成病毒中心和结构蛋白的基因，如基质蛋白（MA）, 衣壳蛋白（CA）和核衣壳（NC）。Pol表达的是Pol多聚蛋白，编码逆转录酶（RT）、蛋白酶（PR）和整合酶（IN）。env基因表达表面包膜糖蛋白（SU）和跨膜（TM）糖蛋白（图二）。逆转录病毒在结合并穿透宿主细胞后，病毒 RNA 被转录成DNA，然后经由使用宿主和病毒编码的蛋白整合到宿主 DNA 中；在合成和组装之后，此复制过程导致感染性病毒颗粒的释出（图三）。

图二、逆转录病毒结果图（http://www.labome.cn/method/Nucleic-Acid-Delivery-Lentiviral-and-Retroviral-Vectors.html）

在基于逆转录病毒的递送载体中，为提高病毒的宿主范围，表达水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）基因的序列已用于代替原病毒的env基因。除此之外，逆转录病毒载体中Ψ和 LTR序列分别是将基因包装到病毒体和整合到宿主所必须的。由于逆转录病毒颗粒缺乏刚性对称结构，通过将感兴趣的外源基因融合到 Gag 和 Pol基因的 N 端，已被证明可将外源基因掺入到病毒颗粒中，并在病毒颗粒成熟期间以蛋白酶依赖性方式从病毒多肽中释放出来（图三）。

图三、逆转录病毒包装基本原理

本文所介绍的类病毒载体正是基于上述逆转录病毒的这些特点。由于类病毒缺乏LTR和整合酶，借用逆转录病毒中的一些结构元件，如Gag 和 Pol基因，将目的基因瞬时表达在细胞中，除此之外，类病毒也可通过整合一些RNA结合蛋白，实现大蛋白的包装，突破AAV病毒的包装瓶颈。类病毒病毒包装过程与常用的慢病毒和AAV病毒相似，仅需将不同的类病毒元件分别表达到293T细胞中，然后进行病毒纯化和浓缩。由于不同类病毒的设计原理各不相同，本文将通过下列三种形式类病毒进行分别介绍。

1. VLP-mRNA

2021年蔡宇伽团队在Nature biomedical engineering 中报道了其自主研发的VLP-mRNA技术，该技术利用慢病毒包装和mRNA茎环结构与噬菌体衣壳蛋白特异识别等原理，可同时兼具病毒识别宿主广谱性及mRNA表达瞬时性等特点（图四）⁸。研究发现Cas9 mRNA通过VLP-mRNA递送，其体内存在时间约为72小时。因此，与长时间表达Cas9的病毒系统相比，VLP-mRNA可以显著降低脱靶效应。另外，VLP-mRNA可以递送整个CRISPR元件（Cas9与gRNA），克服了AAV载体运载能力小的限制。目前，VLP-mRNA已经在小鼠模型中证明可用于治疗疱疹性基质性角膜炎（HSK）。基于VLP-mRNA技术创建的本导基因公司，目前已针对包括病毒性角膜炎、地中海贫血和血友病在内的多种疾病进行临床前研究。

图四、VLP-mRNA技术原理。将MS2噬菌体衣壳蛋白编码基因MS2C添加到Gag基因N端，在目的基因的C端添加mRNA茎环结构MS2； 由于MS2与MS2C存在相互作用，且IN整合酶活性丧失，因此通过VLP-mRNA可实现目的基因的病毒包装和瞬时表达。

2.SEND

SEND系统于2021年被张峰课题组构建，其核心是PEG10蛋白。PEG10作为Gag基因同源物，数百万年前就与人类祖先基因组整合在一起。PEG10蛋白可与自己的mRNA结合，并在其周围形成一个球形的保护囊⁹。张峰团队通过对PEG10与 mRNA结合机制进行深入研究发现PEG10可通过结合其5'和3'端UTR序列，实现对插入到 5'和3'端UTR序列之间的目的序列进行封装。为实现形成的PEG10胶囊可进入细胞，衣壳蛋白如VSV-G和SYNA等融合素蛋白（Fusogen）可对其进行进一步修饰。通过应用类似于慢病毒包装的三质粒包装系统，PEG10可实现目的基因的体内递送（图五）。由于SEND系统可由体内自然产生的蛋白质组成，因此它可能不会触发免疫反应，可实现重复给药。2022年，张峰基于SEND技术创建了Aera Therapeutics公司，并实现2亿美元的融资，该团队计划未来在动物中测试SEND递送能力，并对其进行改造设计，以实现递送的靶向性。

图五、SEND系统包装原理

3. eVLP

2022年，David Liu课题组在Cell发布了该团队开发的一种工程化无DNA病毒样颗粒（eVLP），能有效包装和递送碱基编辑器或Cas9核糖核蛋白¹⁰。由于逆转录病毒颗粒缺乏刚性对称结构，因此可以用于包装一些外源蛋白。基于此，研究人员将外源基因如碱基编辑器ABE8e添加到Gag蛋白的N端，为方便ABE8e在病毒成熟后脱离，在ABE8e和Gag蛋白之间还融合了一段可被病毒蛋白酶切割的linker序列（图六）。当向293T细胞共转染Gag–pol，Gag-ABE8e，sgRNA和VSV-G后，收集细胞上清便可获得ABE8e-VLP病毒颗粒。通过将该病毒颗粒感染细胞便可实现基因编辑。该团队通过对eVLP结构及包装过程优化，最终生成的第四代eVLP系统所能包装的碱基编辑器RNP蛋白量比初始报道高 16倍。由于eVLP是无DNA的，可通过直接递送基因编辑器RNP的形式发挥作用，脱靶性较小，另外RNP的在体内的稳定性低于mRNA，且每个mRNA拷贝可翻译多个RNP蛋白，因此eVLP其脱靶性应该低于瞬时表达mRNA；在体内，eVLP递送的碱基编辑可实现小鼠肝脏63%的细胞编辑，进而将血清中PCSK9水平降低78%；eVLP递送的碱基编辑还可明显改善遗传性失明小鼠模型的视觉。

图六、eVLP工作原理

4.小结

近日，David Liu及其合作者在Cell杂志发表最新综述文章¹¹，将类病毒颗粒作为除病毒载体和纳米颗粒之外的第三种基因药物递送平台进行了详细总结，尽管三种方法各存在优缺点，但不可否认的是，随着对类病毒载体研究改造的深入及其独特之处，其定会在今后的临床试验中崭露头角。

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参考文献：

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1.Anzalone AV, Koblan LW, Liu DRJNb. Genome editing with CRISPR–Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. 2020;38(7):824-844

2.Chandler RJ, Sands MS, Venditti CPJHgt. Recombinant adeno-associated viral integration and genotoxicity: insights from animal models. 2017;28(4):314-322

3.Gillmore JD, Gane E, Taubel J, et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. 2021;385(6):493-502

4.Lee K, Conboy M, Park HM, et al. Nanoparticle delivery of Cas9 ribonucleoprotein and donor DNA in vivo induces homology-directed DNA repair. 2017;1(11):889-901

5.Lee B, Lee K, Panda S, et al. Nanoparticle delivery of CRISPR into the brain rescues a mouse model of fragile X syndrome from exaggerated repetitive behaviours. 2018;2(7):497-507

6.Shahbazi R, Sghia-Hughes G, Reid JL, et al. Targeted homology-directed repair in blood stem and progenitor cells with CRISPR nanoformulations. 2019;18(10):1124-1132

7.Alkilany AM, Murphy CJJJonr. Toxicity and cellular uptake of gold nanoparticles: what we have learned so far? 2010;12(7):2313-2333

8.Ling S, Yang S, Hu X, et al. Lentiviral delivery of co-packaged Cas9 mRNA and a Vegfa-targeting guide RNA prevents wet age-related macular degeneration in mice. 2021;5(2):144-156

9.Segel M, Lash B, Song J, et al. Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery. 2021;373(6557):882-889

10.Banskota S, Raguram A, Suh S, et al. Engineered virus-like particles for efficient in vivo delivery of therapeutic proteins. 2022;185(2):250-265. e16

11.Raguram A, Banskota S, Liu DRJC. Therapeutic in vivo delivery of gene editing agents. 2022;

E.N.D

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