碱基编辑器及其临床相关研究进展

基因编辑改变了生命科学，并在治疗遗传疾病方面展现出令人兴奋的前景。2016年和2017年,刘如谦实验室分别将胞嘧啶脱氨酶或腺苷脱氨酶与Cas9结合从而开创性地建立了第二代基因编辑系统-碱基编辑器（BE）[1,2]。该系统包含胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）可以在不需要模板DNA和双链DNA断裂的情况下分别实现胞嘧啶（C）与胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）与鸟嘌呤（G）核苷酸之间的转化。另外，研究人员近期在CBE的基础上进一步开发了鸟嘌呤编辑器（GBE），可实现现胞嘧啶（C）与鸟嘌呤（G）的特异性转换[3]。碱基编辑器的发现，在实现精确和高效的基因组编辑的同时将最大限度地减少不需要的副产物和与双链DNA 断裂相关的细胞毒性。本文将简单介绍碱基编辑器的基本工作原理并梳理近年来其相关临床研究进展。

胞嘧啶碱基编辑器（CBE）

胞嘧啶碱基编辑器是通过将Cas9切口酶或无催化活性的“死”Cas9(dCas9) 与 APOBEC等胞嘧啶脱氨酶融合而成的。碱基编辑器通过gRNA 靶向特定位点，它们可以在PAM 位点附近的一个小编辑窗口内将胞嘧啶转化为尿嘧啶。由于在哺乳动物体内存在的DNA糖基化酶（UracilDNA glycosylase,UDG）可识别尿嘧啶，并利用碱基切除修复途径（BER）将尿嘧啶重新修复成胞嘧啶，因此CBE一般包含一个尿嘧啶DNA糖基化酶抑制（UGI）以提高碱基编辑效率。CBE产生的尿嘧啶在DNA复制过程中将被当做胞嘧啶，从而产生C 到 T的碱基序列变化（或相反链上的G 到 A）（图1）。CBE原则上可以修复14%突变导致的人类疾病[4,5]。BE3 和BE4 是最常用的胞嘧啶碱基编辑器(CBE) 版本，APOBEC1作为一种哺乳动物胞嘧啶脱氨酶，仅与单链DNA 相互作用。通过sgRNA 指向其靶序列，nCas9打开两条 DNA链。然后，APOBEC1可以在非目标链上的活动窗口内使任何胞嘧啶脱氨基。该窗口长约5 bp，位于PAM 序列上游约15 bp（图1）。除此之外，研究人员还将海鳗的胞嘧啶脱氨酶AID（activation-inducedcytidine deaminase,活化诱导的胞苷脱氨酶）与Cas9n融合在一起而构建出Cas9n-AID碱基编辑器并命名Target-AID，该胞嘧啶碱基编辑器效率与BE3 非常相似，但编辑窗口不同，因此两编辑器之间可相互补充[6]。

腺嘌呤碱基编辑器（ABE）

腺嘌呤碱基编辑器可实现A到 G（或T 到C）的转换，原则上可解决47%的基因致病突变导致的人类疾病。然而在哺乳动物中并无作用于单链DNA的腺嘌呤脱氨酶，为克服这一障碍，刘如谦实验室通过定向进化的方法对大肠杆菌的tRNA 腺苷脱氨酶(TadA)进行筛选获得了一个编辑效率较高的突变体-TadA*。与胞嘧啶碱基编辑器类似，进化的TadA 结构域与Cas9 蛋白融合以创建腺嘌呤碱基编辑器。该编辑器窗口长约4bp，位于 PAM序列上游约12bp。在此窗口内的任何腺嘌呤可被转化为肌苷，肌苷在细胞内视为鸟苷，从而产生A 到 G（或T 到C）的变化（图1）[7]。

图1.胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器工作示意图^[8]

鸟嘌呤编辑器（GBE）

鸟嘌呤编辑器是由与胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶DNA 糖基化酶(UNG) 融合的Cas9 切口酶(nCas9-D10A) 组成。在RNA 的引导下，胞嘧啶脱氨酶将靶标C 转化为U。UNG从 DNA 中消除U 并产生无嘌呤/无嘧啶(AP) 位点。AP 位点的创建，再加上nCas9 在DNA非编辑链上的切口，启动DNA 修复和复制，导致G 在 AP位点的有利插入。这些事件导致了C 到 G的编辑结果(图2)。然而，目前尚不清楚G 的引入如何优于其他两个碱基(T和A) [9,10]。相比之下，CBE含有一种 UNG抑制剂 (UGI)，可阻止U 的去除并随后增加C-to-T 编辑结果的可能性。在结构上，CBE和 CGBE 是相似的，只是GBE 包含 UNG而不是 UGI。除了通过引入UNG以消除U外,陈等人通过在APOBEC1-nCas9的 C末端融合了一种碱基切除修复(BER) 蛋白-XRCC1，构建了另外一种GBE（图2）。一旦APOBEC1 诱导DNA序列中C到 U 的转换，细胞内源性UNG蛋白便通过去除U 创以建一个AP 位点，之后XRCC1 通过招募其他BER 蛋白来修复AP 位点，导致G 成为主要的修复产物[11]。与大多数CBE 和 ABE更喜欢原间隔区(protospacer)4-8 位的目标碱基不同，CGBE在位置6显示出最佳活性。尽管在位置5 和 7也显示出可观的编辑，但CGBE 主要作用于C6 位置。然而，CGBE并非在所有 C6位点都同样有效[3]。

图2.鸟嘌呤碱基编辑器工作示意图^[3]

双碱基编辑器

通过将胞嘧啶脱氨酶、腺嘌呤脱氨酶和Cas9切口酶相融合，研究人员近期开发出了腺嘌呤和胞嘧啶双碱基编辑器（ACBE），这一双碱基编辑器可以在同一靶标位点实现C-T和A-G转化（图3），研究表明ACBE的C-T编辑效率与CBE相当，对A-G编辑效率则略有降低；但总体来说该双碱基编辑器效率高于CBE+ABE[12-14]。

图3.ACBE碱基编辑器工作示意图^[13]

另外，2022年赖良学课题组通过将GBE和ABE融合构建出AGBE编辑器，由于GBE除可实现C-to-G转换外，还存在C-to-T和C-to-A两种副产物（图4）。因此利用AGBE对C-to-G、C-to-T、C-to-A和A-to-G的编辑特性，可用其建立饱和突变群体，以通过高通量筛选验证多种基因突变模式如单核苷酸变异(SNV) 的功能及相关表型[15]。

图4.AGBE碱基编辑器工作示意图^[15]

碱基编辑器的临床相关研究进展

总体来说，目前胞嘧啶碱基编辑器，腺嘌呤碱基编辑器和鸟嘌呤碱基编辑器可分别达到~50%，~40.87to 64.22%和~15%的编辑效率[16-18]。由于ABE和CBE技术发展相对成熟、效率较高，因此广泛应用于临床前的相关研究，并发表在Nature等高水平文章中。

图5.碱基编辑器临床相关文章（截止2022.3）

AAV病毒常用于临床及临床前动物实验，因为它可瞬时表达基因，并具有较低免疫原性和毒性。除此之外，AAV病毒存在多种血清型，已被鉴定为具有不同的组织嗜性，因此AAV可介导基因的组织特异性表达。AAV已被用于将基因组编辑器传递到各种人体组织，包括大脑、心肌以及眼睛等。尽管AAV存在上述多种优势，但使用AAV 作为 DNA碱基编辑器的治疗递送工具尚存在技术瓶颈，因为它的包装容量仅为4.7 kb。野生型SpCas9（最常用的DNA 基因编辑器变体）的大小为4.3kb，由于超出了大小限制，因此无法继续包装嘧啶/嘌呤脱氨酶、gRNA、合适的启动子和必要的病毒元件。为此，多个研究组开发了内含肽剪切(intein-split)碱基编辑器来规避有限的AAV 包装容量。在这些研究中，碱基编辑器分为N 端和 C端片段，然后每个片段融合到内含肽的一半。拆分的碱基编辑器可分别通过AAV进入细胞并重新整合成全长碱基编辑器。Split-CBE和Split-ABE已通过AAV被递送到小鼠的大脑、肝脏、视网膜、心脏、骨骼肌和内耳，以纠正肌萎缩侧索硬化症、苯丙酮尿症、C型尼曼-皮克病和遗传性耳聋等人类遗传病小鼠模型。

图6.Split-CBE工作示意图^[19]

2022年7月，VerveTherapeutics 公司宣布，为治疗杂合子家族性高胆固醇血症（HeFH）而开发的碱基编辑疗法VERVE-101在新西兰完成了首例患者给药，这是首个体内碱基编辑的临床试验，标志着碱基编辑器进入临床应用阶段。VERVE-101作为腺嘌呤碱基编辑器，最初由Beam 开发，其通过改变PCSK9 的外显子-内含子交界处的碱基，导致PCSK9mRNA错误剪接以介导其mRNA无义降解，从而降低PCSK9蛋白水平。该治疗方法以编码碱基编辑器的mRNA 和 gRNA的方式，通过脂质纳米颗粒(LNP) 的形式递送到肝脏。在食蟹猴中，单次静脉输注VERVE-101 几乎完全抑制了肝脏中的PCSK9，并将血清LDL 胆固醇水平降低了60%，这些效果在猴子身上可以维持600 天。除了VERVE-101，还有多款碱基编辑器正进行IND申报及临床前研究阶段（Table1）[20]。

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参考资料：

1. Komor,A.C., et al., Programmable editing of a target base in genomic DNAwithout double-stranded DNA cleavage. 2016. 533(7603): p.420-424.

2. Gaudelli,N.M., et al., Programmable base editing of A• T to G• C ingenomic DNA without DNA cleavage. 2017. 551(7681): p.464-471.

3. Molla,K.A., et al., Base editing landscape extends to performtransversion mutation. 2020. 36(12): p. 899-901.

4. Landrum,M.J., et al., ClinVar: public archive of relationships amongsequence variation and human phenotype. 2014. 42(D1): p.D980-D985.

5. Rees,H.A. and D.R.J.N.r.g. Liu, Base editing: precision chemistry onthe genome and transcriptome of living cells. 2018. 19(12):p. 770-788.

6. Nishida,K., et al., Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryoticand vertebrate adaptive immune systems. 2016. 353(6305):p. aaf8729.

7. Caso,F. and B.J.L.A. Davies, Base editing and prime editing inlaboratory animals. 2022. 56(1): p. 35-49.

8. Hwang,G.-H., et al., Web-based design and analysis tools for CRISPR baseediting. 2018. 19(1): p. 1-7.

9. Kurt,I.C., et al., CRISPR C-to-G base editors for inducing targeted DNAtransversions in human cells. 2021. 39(1): p. 41-46.

10. Zhao,D., et al., Glycosylase base editors enable C-to-A and C-to-G basechanges. 2021. 39(1): p. 35-40.

11. Chen,L., et al., Programmable C: G to G: C genome editing withCRISPR-Cas9-directed base excision repair proteins. 2021. 12(1):p. 1-7.

12. Grünewald,J., et al., A dual-deaminase CRISPR base editor enables concurrentadenine and cytosine editing. 2020. 38(7): p. 861-864.

13. Zhang,X., et al., Dual base editor catalyzes both cytosine and adeninebase conversions in human cells. 2020. 38(7): p. 856-860.

14. Xie,J., et al., ACBE, a new base editor for simultaneous C-to-T andA-to-G substitutions in mammalian systems. 2020. 18(1): p.1-14.

15. Liang,Y., et al., AGBE: a dual deaminase-mediated base editor by fusingCGBE with ABE for creating a saturated mutant population withmultiple editing patterns. 2022. 50(9): p. 5384-5399.

16. Koblan,L.W., et al., Improving cytidine and adenine base editors byexpression optimization and ancestral reconstruction. 2018.36(9): p. 843-846.

17. Fu,J., et al., Human cell based directed evolution of adenine baseeditors with improved efficiency. 2021. 12(1): p. 1-11.

18. Yuan,T., et al., Optimization of C-to-G base editors with sequencecontext preference predictable by machine learning methods. 2021.12(1): p. 1-11.

19. Levy,J.M., et al., Cytosine and adenine base editing of the brain,liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associatedviruses. 2020. 4(1): p. 97-110.

20. Kingwell,K.J.N.r.D.d., Base editors hit the clinic.

E.N.D

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