基因治疗：用于 RNA 治疗的药物递送系统

基于 RNA 的基因治疗需要治疗性 RNA 在靶细胞内发挥作用，而不会引发不需要的免疫反应，可以使用非病毒药物递送系统将 RNA 运送到细胞中，这绕过了病毒递送载体的限制。作者描述了基于聚合物、基于脂质的药物递送系统，区分被动靶向特定细胞类型和主动靶向特定细胞类型的药物递送系统。本文描述了从临床前给药研究到临床批准的路径，强调了提高给药系统递送效率的机会。

RNA疗法可以操纵基因表达或产生治疗性蛋白质，使这些药物适用于具有既定遗传靶点的疾病，包括传染病、癌症、免疫疾病和孟德尔疾病（包括神经疾病）。然而，操纵这些靶点的能力，尤其是非编码DNA和85%的基因组在没有向患病细胞输送治疗性RNA的能力的情况下会减弱。一些治疗性RNA（如mRNAs）的大尺寸、它们的阴离子电荷以及它们对血液和组织中存在的RNA酶的敏感性使得治疗性RNA难以有效地进入细胞并自行发挥作用。

为了克服安全有效地传递RNA的障碍，科学家开发了基于病毒载体和非病毒传递系统，以保护RNA不被降解，最大限度地向靶细胞传递，并最大限度地减少对非靶细胞的暴露。

治疗性RNA疗法

RNA药物通常根据用于操纵基因或基因表达的生化作用机制进行分类（图1）。在设计药物递送载体时，重要的是考虑这些作用机制如何影响临床相关药物递送的要求。寡核苷酸药物，如ASOs和siRNA，分别利用真核细胞内源性酶，如核糖核酸酶H1或RNA诱导沉默复合物（RISC），通过不需要传递大的酶来促进传递。

图1. 不断扩大的治疗性 RNA 有效载荷领域

有两类RNA疗法，一类RNA疗法通过输送小RNA分子（图1a）。小干扰RNA（siRNA）可通过RNA诱导沉默复合物（RISC）介导的mRNA降解降低基因表达，反义寡核苷酸（ASOs）可通过结合剪接位点改变亚型，作用于RNA ASOs的腺苷脱氨酶（ADAR-寡核苷酸）可编辑RNA。在这三种情况下，这些小RNA都可以通过化学合成进行特定位点的化学修饰来设计，并可以通过纳米颗粒或偶联物传递系统来传递。

siRNA的快速临床应用有三个特点。首先，可利用化学合成来制造带有特定位点化学修饰的siRNA，改变siRNA不同化学修饰的组合能够改善其药代动力学特性、先天免疫反应和稳定性。第二，siRNA利用真核细胞内源性的RISC，因此不需要传递带有核酸酶结构域的大型酶。最后，考虑到siRNA干扰成熟mRNA，它只需要细胞质传递，这比核传递更容易实现。

ASOs是分子量为6–9 kDa的寡核苷酸，可以通过三种作用机制发挥作用（图1a）。首先，与siRNA类似，ASO通过碱基配对结合mRNA，但与siRNA不同，ASO DNA–RNA异源双链招募RNase H1而不是RISC，导致靶RNA的裂解。其次，ASOs还可以通过与pre mRNA相互作用干扰剪接机制，从而促进选择性表达并增加靶蛋白表达。第三种模式通过与靶基因mRNA的翻译起始密码子结合来阻止靶基因蛋白的翻译。

化学修饰的具有反义靶结合基序的寡核苷酸设计有一个工程化的发夹结构域，该结构域招募作用于RNA（ADAR）的内源性RNA编辑酶腺苷脱氨酶（图1a）。这些ADAR寡核苷酸的分子量约为10–35 kDa，可以通过特定位点的化学修饰来制造，它们使用单链RNA结构域通过碱基配对与靶mRNA结合。另一个域将ADAR招募到RNA中，ADAR将腺苷转化为肌苷；肌苷随后被内源性翻译机制解读为鸟苷，导致A到I到G 的RNA编辑。从A到I到G的编辑可以发生在成熟的mRNA上，这表明ADAR寡核苷酸的细胞质传递足以达到效果。因此，ADAR寡核苷酸代表了一类用于治疗遗传疾病的新兴寡核苷酸。

另一种治疗性RNA是mRNA，它可以编码具有治疗活性的蛋白质。由于其大小，mRNAs是在体外转录的，目前无法通过化学合成进行特定位点的化学修饰（图1b）。mRNA还可以暂时表达锌指核酸酶、转录激活物样核酸酶或来源于CRISPR–Cas系统的核酸酶。设计用于操纵DNA的核酸酶特别适合基于mRNA的疗法，因为它们表达的蛋白只存在几个小时或几天，但是表达的DNA核酸酶可以产生长效的基因编辑结果。RNA核酸酶可结合和切割RNA，或通过用ADAR结构域进行工程，也可使RNA碱基编辑（图1c）。RNA核酸酶的非病毒介导传递促进了基因表达的短期变化。因此， RNA核酸酶可能更适用于短期疾病，如暂时性炎症，或由RNA病原体驱动的疾病，如冠状病毒。

用于RNA递送的合成载体

尽管不同的RNA疗法可能具有不同的作用机制，但它们都必须避免被非靶器官清除，必须进入正确的组织，而不会引发有害的免疫反应。目前，科学家们已经开发了多种RNA递送系统。

脂质和基于脂质的纳米颗粒。  基于脂质的递送系统包括胶束（micelles），脂质体（liposome）和脂质纳米颗粒（LNP）（图2a）。胶束由单层脂质分子构成，脂质体由双层脂质分子构成，而LNP则包含多层脂质，并且携带由脂质和核酸结合成的微域。FDA批准的LNP含有四种基本成分的变体：阳离子或电离脂质、胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇（PEG）修饰脂质（图2b，c）。鉴于脂质结构会影响脂质的传递，而且脂质可以通过化学反应轻松合成，科学家们已经创建了数千个化学性质不同的脂质传递系统的库。尽管大多数临床前研究已经评估了阳离子或电离脂质的结构如何影响传递，但其他三种成分也会影响传递。例如，改变PEG脂质结构或其摩尔百分比会改变LNP在小鼠体内的药代动力学和肝脏siRNA传递，并影响眼睛内的传递。

图2. FDA批准的基于脂质的结构包含四种基本成分的一些变体

此外，改变LNP的脂质组分或者添加新的脂质分子，可以促进LNP递送到肝脏以外的组织。Intellia Therapeutics和Beam Therapeutics公司都已经分享了将mRNA递送到小鼠的造血干细胞和祖细胞中的LNP信息，从而有望开发靶向体内造血干细胞疗法。

聚合物和聚合物基纳米颗粒。  许多非病毒RNA递送系统也利用聚合物和基于聚合物纳米颗粒（图3a）。化学家可以改变聚合物的特性，包括电荷、可降解性和分子量，所有这些都会影响聚合物如何将RNA传递到细胞。比如含有胺基的聚合物可变成阳离子，然后可以通过静电相互作用与RNA结合，并将其输送到细胞。另一类阳离子聚合物是聚β-氨基酯（PBAEs），这些聚合物具有更好的生物降解性和细胞毒性，含有阳离子胺和可生物降解的酯键。研究人员还合成了脂质-聚合物混合物，发现向PBAE中添加脂质可改善血清稳定性和输送量。

用于RNA传递的另一类聚合物是树状大分子，它由一定数量的支链单体组成，这些单体来自中心核心分子（图3b）。由阳离子基团合成的树枝状大分子，例如聚氨基胺（PAMAM）或PLL，可以形成复合物并将RNA输送到细胞中。树状大分子已将RNA输送到中枢神经系统，作为对抗埃博拉和H1N1病毒的肌肉内疫苗，并将siRNA输送到肝内皮细胞。树状大分子结构也可被修饰以保护核酸免受酶降解，并增强内体逃逸。

图3. 可以使用由聚合物或树枝状大分子配制的纳米颗粒来递送 RNA

主动与被动组织靶向

被动组织靶向。研究表明，最初为肝脏siRNA或mRNA递送而开发的LNP可以重定向到其他器官，这种重定位可能是由内源性转运途径中纳米颗粒和血清蛋白之间的相互作用驱动的（图4a）。随着球体变小，其表面积与体积比增加；因此，纳米颗粒具有较大的表面积，当纳米颗粒与生物环境接触时，许多生物分子可以覆盖其表面。这些与纳米颗粒表面结合的蛋白质改变了纳米颗粒表面的化学和生物分子，从而改变了纳米颗粒与免疫细胞和靶组织的相互作用方式。在一个临床例子中，载脂蛋白E（ApoE）吸附是可电离脂质向肝细胞输送siRNA所必需的，它导致LNP通过低密度脂蛋白受体（LDLR）被肝细胞吸收。

主动靶向。RNA也可以通过“主动靶向”转移到靶细胞中。在这种策略中，将结合特定生物分子的配体添加到递送系统中（图4b-d）。临床验证最充分的例子是GalNAc–siRNA和GalNAc–ASO结合物，FDA批准的疗法givosiran、lumasiran和inclisiran都采用了这种策略。GalNAc是一种碳水化合物衍生的三价配体，与去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）结合（图4b）。ASGPR是一种理想的主动靶向受体：它在靶细胞上高度表达，在其他细胞类型上不表达，在GalNAc结合时导致快速内吞，并在内吞后快速再循环到细胞表面。这种理想的受体和优化的配体的结合导致了siRNA和ASO的皮下递送剂量远远低于在大动物模型中引起毒性的剂量。

图4.药物输送载体可以使用两种作用机制来达到它们的目标细胞类型

有一种独特的靶向机制需要使用抗体片段或抗体来靶向细胞类型。例如，siRNA和ASO也已使用抗体-siRNA结合物输送到肝外组织（图4c）。在一个例子中，抗CD71抗体片段将siRNA传递到心脏和骨骼肌，导致靶基因沉默延长。因此，Avidity Biosciences于2021年启动了一项I期/II期临床试验，提供针对强直肌营性养不良蛋白激酶的siRNA，以治疗I型强直性肌营养不良。

ASO和siRNA由于分子量较小，可以通过直接偶联小分子或抗体达到主动靶向的效果。而mRNA的分子量太大，因此它们的主动靶向递送策略依靠在装载mRNA的纳米颗粒表面装饰抗体（图4d）。比如，研究人员已经开发出一套依靠在LNP中携带的脂蛋白递送siRNA或mRNA的系统。这一系统利用固定在LNP表面的脂蛋白与抗体的Fc端相结合，改变抗体的可变区就可以让LNP靶向不同的细胞。这一系统已被用于靶向肝外细胞，治疗炎症性肠病。

图5. 临床前纳米粒子发现管道

临床RNA传递途径

作者指出，不管使用哪种靶向机制和化学结构，基于纳米颗粒的RNA递送系统需要经过一系列临床前实验的筛选。这些实验通常从基于细胞系的高通量筛选开始，最初可能需要检验上千种纳米颗粒，然后一小部分被选出进行小鼠实验，更少的几种被用于进行非人灵长类动物实验（图5a）。只有在非人灵长类实验中表现出足够安全性的纳米颗粒才有可能进入临床开发阶段。

这一流程虽然已经开发出成功递送RNA的纳米颗粒，但是仍然有进一步提高开发效率的空间。比如，化学家可以合成上千种纳米颗粒，但是同时在上千只小鼠中进行实验验证它们的体内递送效率并不现实。因此，最初的纳米颗粒评估通常在细胞系中进行，但是细胞培养环境下的递送结果不能有效预测体内递送的效率。为了解决这个问题，科学家已经开发出DNA条形码系统，让在动物体内同时检测上千种纳米颗粒成为可能。在这一系统中，不同的LNP虽然携带同样的RNA，但是配方中加入了不同的DNA条形码。科学家们可以将携带不同条形码的LNPs混在一起注射到小鼠体内，然后收集靶标组织或细胞，分离并且检测所有条形码的水平。这一策略已经被用于开发不需要靶向配体就能将RNA递送到非肝细胞组织的纳米颗粒。

另一条改进纳米颗粒开发效率的途径是了解哪些小动物模型能够最好地预测在非人灵长类动物中的递送效果。不同物种间的差异，比如基础代谢率、血清脂质种类，器官体重比等等，都可能影响递送的效率。比如，与非人灵长类相比，小鼠和大鼠肝脏与体重的比例更高，这可能增强小鼠和大鼠中肝脏对RNA的摄入（图5b）。综述作者表示，发现能够最大限度预测在非人灵长类动物中递送效果的小动物模型将是推动整个RNA疗法领域的重要进展之一。

图6. 临床相关递送系统的标志

临床RNA递送系统的特征

根据FDA已经批准的RNA药物递送系统，综述作者总结了六个主要特征（图6），它们是①合成手段使用可扩展的化学手段并且通常可以被生物降解。比如，向可电离脂质中引入酯键可以提高LNP的安全性。②化学合成途径足够简单，可以在人体范围内制造。③药物递送系统需要有可以接受的靶向和脱靶递送比率。靶向和脱靶递送需要同时使用生物分布和功能化指标来衡量。因为95%的RNA可能被保留在内体（endosome）中，生物分布并不见得能够预测RNA的功能性递送。④产生疗效的RNA剂量必须显著低于可能产生毒性的剂量。理想情况下，毒理研究应该在非人灵长类动物中进行。⑤药物的活性应该在不同批次之间保持一致。⑥在大多数临床环境下，重复给药不会导致疗效或安全性的丧失。

在过去的十年里，临床前和临床数据暗示了RNA疗法治疗疾病的潜力。结果。如果我们能够扩大我们对RNA药物、药物输送系统和身体如何相互作用的理解，患者将受益于有效的下一代基因疗法。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41576-021-00439-4

翻译整理/姜思琦

编辑/王巧琪

来源：细胞与基因线路设计

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