一文读懂体外基因疗法中最常用载体----慢病毒载体现状与进展

作为载体，慢病毒（Lentivirus，LV）能够转导分裂和非分裂细胞，如神经元、造血干细胞和免疫系统的细胞，对原代细胞和细胞系均有感染效果，能够传递高达11kb大小的转基因并整合进入基因组。由于其较广的感染谱和优良的感染效果，在科研领域，慢病毒已经成为最常用的工具载体，通过对基因进行各种操纵帮助人们揭示生命的奥秘。

在临床一线，慢病毒载体可用于细胞和基因治疗，将具有治疗效果的基因转移和整合到受体细胞中，从而使患者获益。LV是治疗单基因疾病和需要基因修饰的过继性细胞治疗的主要载体，在美国、中国、欧盟和加拿大有100多个临床试验正在使用慢病毒载体进行细胞体外修饰或体内治疗。其中最引人注目的慢病毒相关药物为CAR-T药物获批上市。目前全球共有7款CAR-T药物，其中既包括于2022年2月底于FDA获批上市，治疗多发性骨髓瘤的中国制药企业传奇生物的西达基奥伦塞；也包括2022年2月揭示10年长期缓解效果的全球第一款CAR-T药物Kymrias。虽然CAR-T相关药物目前仅局限于血液肿瘤，但随着人们对疾病和药物的进一步研究，能够治疗实体瘤或其他疾病的慢病毒相关药物应会接踵而至。此外，目前，获批上市的非CAR-T类体外基因疗法中采用慢病毒作为载体的基因疗法有Zynteglo、Skysona和Libmeldy，其适应症分别为：β-地中海贫血（2019年获欧盟批准上市）、脑肾上腺脑白质营养不良（2021年7月获欧盟批准上市）、异染性脑白质营养不良（2020年12月份获欧盟批准上市）。

既然慢病毒在科研和临床中都发挥着至关重要的作用，那么，慢病毒到底是从何而来，它的结构又是怎样的呢？

慢病毒改造自人免疫缺陷病毒（HIV，Human Immunodefificiency Virus），其属于逆转录病毒科，慢病毒属。和其他逆转录病毒一样，其遗传信息储存在正义RNA上，经过逆转录转变成DNA并可整合入宿主细胞基因组。所有的逆转录病毒家族都编码开放阅读框gag、pol和env，但基因组的组织形式和调控蛋白各有差异。HIV的基因组、编码蛋白及颗粒结构如下：

图片来自：10.3390/ph6121507

从野生型HIV病毒中开发慢病毒载体需要对病毒基因组进行评估和病毒成分的选择，以确保安全和高效的基因转移。如上图所示，艾滋病毒基因组包含能够编码功能、结构和辅助作用蛋白的反式作用因子，如Pol、P24和各种功能酶；也包含非编码的顺式作用元件如协助转录和包装病毒RNA、开启区域逆转录和基因组整合的长末端重复(LTR)。因此，慢病毒载体的初步发展包含分离顺式反式作用元件到各个质粒。在这个过程中，原来HIV-1的包膜蛋白被替换成其他包膜蛋白，如小鼠白血病病毒(MLV)的包膜蛋白或来自水泡性口炎病毒的糖蛋白（VSV-G），以更改和扩大慢病毒的感染谱系。随后的几代病毒都采用了连续的改进，以提高滴度和安全性，去除不必要的病毒序列，如辅助蛋白vif、vpr、vpu和nef。

图片来自：CanadianBiosafety Guideline - Lentiviral Vectors

现在，第三代包装系统以3-4个质粒为主。在第一个辅助质粒中去除了tat，用一个组成型启动子替换5‘LTR中的U3启动转录以提高安全性；为了进一步保持安全性和载体滴度，将rev放置在了另外一个单独的质粒；在自失活的穿梭质粒中放入我们感兴趣的目的基因，其两侧是带有rev响应元件的HIV-1LTRs；另外还有表达包膜蛋白的第四个包膜质粒。将这些质粒共转染即可包装出具有单一感染效果的慢病毒。

病毒包装结束后，无论在科研还是在临床研究过程中，对病毒的进行定量都是直接影响后续使用效果的关键过程。如上图所示，P24蛋白是构成慢病毒衣壳的主要结构蛋白，每个病毒颗粒均含有约2000个P24蛋白分子。因此，通过测定慢病毒中含有的P24蛋白含量即可转换得到慢病毒的颗粒量。

CDE发布的《CAR-T细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑药典》和《基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则》等相关指导原则中明确指出:病毒载体中需要通过P24抗原含量检测病毒载体的颗粒数量。P24ELISA法是最经典也是目前应用最广泛的定量慢病毒颗粒数的方法，通过与HIV-1P24特异性结合抗体上连接的酶催化底物反应显色来测定慢病毒P24含量，进而通过标曲推算其滴度。最常见的为抗体夹心ELISA法，先将捕获抗体固定在ELISA板上，用于特异性结合HIV-1P24，然后被捕获的P24蛋白通过和检测抗体结合并加入底物实现酶促显色反应进行定量。据估计，每个慢病毒粒子含有2000个P24分子，1ng的P24相当于1.25×1E7个慢病毒（Sena-Esteves M, Gao G.2018:281-285）。该方法通常用于纯化后的慢病毒，优点是重现性和特异性较好。BlueKit 品牌的一款适用于检测任何基于HIV-1慢病毒P24蛋白含量的ELISA试剂盒，在检测范围，灵敏度和精密度测试上都有很好的数据。

标准曲线：

P24含量检测测出的是慢病毒的物理滴度，虽然不能直接反映病毒感染活性，但对慢病毒质量具有重要的参考意义，如上所述此法是慢病毒常规定量检测的主要方法之一，也是慢病毒质控相关指导原则中明确规定的常用质控方法。Delenda C等人报道，流式细胞法测定的慢病毒感染滴度与P24含量测定法计算的物理滴度的比值通常在1/100~1/1000（DelendaC, Gaillard C. , 2005, 12,S1: S36-S50）。

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