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AAV制备工艺面临的挑战及应对策略(2)

张爱龙 细胞与基因治疗领域 2022-12-21

上一篇(全文链接:AAV制备工艺面临的挑战及应对策略(1))我们重点讨论了AAV生产工艺的上游培养和下游纯化过程中面临的各项主要挑战及应对策略。

在本篇,我们将针对缓冲液对AAV稳定性的影响及其改进策略展开详细讨论。目前针对AAV储存液配方系统性深入研究的文章或报告鲜有报道。但我们可以参考更为成熟的重组蛋白药物,合适的储存液配方和制剂辅料可显著提高重组蛋白药物的稳定性,已是不争的事实。同样的策略也适用于AAV制剂,通过添加适合的制剂辅料可以有效增加生物制品的溶解性,提高其物理化学上的稳定性。能够增加生物制品稳定性的辅料种类也有很多,例如糖、盐、聚合物、表面活性剂和氨基酸等,它们可通过与蛋白质、器皿表面或水之间的相互作用来增加蛋白质的稳定性。

(1)渗透剂:渗透液是一种小分子有机化合物,可广泛应用于增加蛋白质稳定性,防止蛋白质变性和聚集。水溶液中的蛋白质处于一种折叠(F,folded)和展开(U,unfolded)之间的平衡状态。稳定作用通过一种优先排斥机制发生,将蛋白质溶液平衡向F状态方向移动。在生物制药配方中使用最广泛的渗透剂有蔗糖、甘氨酸、甘露醇、组氨酸、葡萄糖、精氨酸、海藻糖和乳糖。此外,蔗糖还可显著提高载体产量,例如,在细胞培养基中加入0.2M蔗糖,使AAV2和rAAV2-retro的产量分别提高了1.9倍和1.5倍(见下图),这可能是由于蔗糖在下游苛刻的纯化过程中提高了AAV稳定性所致【1】。有趣的是,蔗糖处理对AAV5产量却没有显著影响。同时蔗糖还具有成本低、易获取、安全性高等优点,可以被广泛用于各种生产制剂过程中。

(2)缓冲液和pH:缓冲液和pH对于病毒衣壳蛋白的构象和胶体稳定性具有非常重要的影响,蛋白质仅在一个非常窄的pH范围内可以保持稳定。pH决定了蛋白质分子上的净电荷及溶液中蛋白质间的静电相互作用。一般来说,净电荷越高,由于静电排斥而引起的蛋白聚集倾向就会越低,胶体的稳定性则会越高。

缓冲液和pH还可以影响载体的稳定性和活性。Venkatakrishnan B 等人报道了pH对AAV衣壳的结构的影响,当pH从7.5降低到4.0时,AAV1和AAV6中衣壳蛋白VP1结构域的a-螺旋结构逐渐消失;当pH增加到7.5时,这种结构变化被逆转【2】。AAV载体在低pH值条件下稳定性较差,因此磷酸盐缓冲液并不适合在冷冻条件下储存病毒载体,由于其成分的溶解性较差,在冷冻期期间会产生选择性沉淀,导致 pH 值降低,可能会进一步引起AAV衣壳变性。

上图a,显示了不同缓冲液成分对AAV热稳定性的影响,表明不同的缓冲液对不同血清型AAV的热稳定性有不同的影响。上图b显示了在柠檬酸缓冲液中pH(pH=3~7)对AAV1、AAV2、AAV5、AAV6.2、AAV8和AAV9载体的热稳定性的影响,结果表明AAV的热稳定性受到pH值变化的强烈影响,并且针对不同血清型AAV的影响是不同的,AAV1、AAV6.2和AAV9的热稳定性在pH5和pH7之间相对较高,而在pH3和pH5之间显著降低。AAV2和AAV8的热稳定性在pH5时达到最大,而AAV5的热稳定性在pH3到pH7逐渐升高【3】。

(3)盐:盐类对衣壳蛋白稳定性的影响是复杂的,这取决于盐的类型、盐浓度、离子间相互作用以及蛋白质中带电残基之间的静电相互作用等因素。在蛋白质水溶液中,加入少量的中性盐[即稀浓度],如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等,会增加蛋白质分子表面的电荷,增强蛋白质分子与水分子的作用,从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合,可以保护蛋白质,具有让蛋白质不易变性,稳定性更高的优点。将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)具有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,破坏蛋白质的胶体性质,蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。此外,盐效应强烈地依赖于溶液pH,因为pH决定了蛋白质基团中可电离氨基酸的带电状态,大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度度最低【4】。

上图显示了AAV2溶解聚集状态受到盐浓度和盐种类影响的情况。与一定浓度的氯化钠溶液相比,相对较低浓度的多价离子盐足以防止AAV的聚集。例如,可以阻止AAV聚集,而~350mOsm的氯化钠可以防止AAV聚集,而~200mOsm的硫酸镁就能达到类似的效果。

(4)表面活性剂:蛋白质可以在剪应力或暴露于空气-水界面时变性、聚集甚至沉淀,导致形成可溶性和不溶性聚集物。AAV在制备纯化过程中的溶液扰动增加了空气/水界面的接触面积,由于空气/水界面是疏水的,蛋白质在界面上重新定位并暴露疏水区域,以最大限度地发挥它们与界面的相互作用。蛋白质的疏水区域增加了分子间蛋白质−蛋白相互作用的机会,从而增加了蛋白质聚集的概率。衣壳蛋白的聚集一方面降低了AAV回收率,一方面可提高了AAV免疫原性,降低其药效。目前蛋白制剂开发生产中及上市产品中,为了提高蛋白质的稳定性,非离子表面活性剂是一种必要的添加辅料。在低浓度非离子表面活性剂情况下,表面活性剂优先占据溶液中的疏水界面,竞争性的抑制溶液中蛋白质分子与疏水界面的接触(竞争界面吸附),从而对蛋白质起到保护作用,随着非离子表面活性剂浓度的升高,表面活性剂与蛋白质分子表面少量疏水位点结合,可抑制蛋白质分子与蛋白质分子间的相互作用,从而抑制蛋白质聚集。目前蛋白质制剂中使用较为广泛的非离子表面活性剂,例如吐温80、吐温20、泊洛沙姆188(poloxamer 188)、PF-68(Pluronic F68)等。目前已上市的两款AAV制品,Luxturna和Zolgensma采用的表面活性剂为泊洛沙姆188。此外,众多研究结果表明通过在AAV制剂中添加PF-68(Pluronic F68)可有效降低了AAV的吸附,增加了AAV的回收率,下图显示了Bennicelli 等人的研究结果【5、6】。

(5)自由基清除剂:蛋白质中氨基酸氧化是蛋白化学不稳定的主要因素之一,其中蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸、酪氨酸和色氨酸等易被氧化。Reinauer EB 等人研究表明腺病毒载体Ad5对自身蛋氨酸氧化敏感,通过病毒载体制剂中添加游离蛋氨酸,能够有效抑制腺病毒载体的失活【7】。此外,由于生产原料及辅料中的金属离子杂质的影响,衣壳蛋白易遭到氧化。Evans RK等人研究表明在以蔗糖为低温保护剂,吐温80为非离子表面活性剂的病毒载体制剂配方(A105)中,金属离子引发的氧化是Ad5失活的重要机制,使用游离氨基酸(如蛋氨酸、组氨酸等)和金属离子清除剂(如乙醇、EDTA和DTPA等)可以防止病毒载体的氧化【8】。

(6)通过化学修饰来稳定病毒载体:随着合成技术的快速发展,通过化学修饰生物大分子来改变生物大分子特性,增强其稳定性等策略得到了广泛应用,如 PEG(聚乙二醇)修饰蛋白已经成功实现商品化。PEG常被用于改善蛋白质药物的药代动力学和药效学,是一种常用于修饰病毒的高分子材料,并已被研究用于病毒载体的保护,PEG的末端羟基能够被亲电基团取代得到活化的PEG,该衍生物能够进一步与病毒衣壳氨基酸反应从而对病毒进行修饰,在AAV生产制备过程中可增加AAV稳定性。Yao T等人的研究表明PEG修饰后的AAV在人类血清中稳定性提高了1.7-2.4倍,被抗体识别率明显降低【9】。此外,Mathieu Mével等人通过突变VP3序列和引入非自然氨基酸,可以改变AAV衣壳的某些特异性。AAV2衣壳中的丝氨酸、苏氨酸和赖氨酸残基突变为丙氨酸或精氨酸可以提高AAV在细胞内稳定性,进而提高其转导效率【10】。Zhang C 等人将一种功能化的RGD肽移植到转基因AAV的衣壳上,可使其特异性靶向肿瘤细胞【11】。

(7)避免由于微生物污染导致的不稳定:针对AAV制品的稳定性研究,除了上述的物理不稳定性和化学不稳定性外,生物学与微生物学稳定性也是需要考虑的因素之一,药物制剂受微生物污染易使产品变质、腐败,尤其是液体制剂产品。而AAV制品大多数情况下都是液体制剂,极易受到微量微生物污染的威胁。因此,在AAV的灌装过程中需要符合法律法规对于无菌灌装的要求,以保证最终产品的无菌性、无热原、无可见异物、无可溶性微粒等。

综上所述,本系列文章(1、2)概述了AAV载体生产制备过程中遇到的多种挑战,重点分析了影响AAV稳定性的多种因素及其相关的机制,并提出了一些应对策略,为广大工艺开发人员勾勒出了一幅提升病毒载体生产制备效率和提高产品稳定性的路线图。

参考资料:

(可上下滑动查看) 

1. Rego M, Hanley LM, Ersing I, et al. Improved yield of AAV2 and rAAV2-retro serotypes following sugar supplementation during the viral production phase. bioRxiv. Published online. 2018:1–21.

2. Venkatakrishnan B, Yarbrough J, Domsic J, et al. Structure and dynamics of adenoassociated virus serotype 1 VP1-unique N-terminal domain and its role in capsid trafficking. J Virol. 2013;87(9):4974–4984.

3. Pacouret S, Bouzelha M, Shelke R, et al. AAV-ID: a rapid and robust assay for batch-to-batch consistency evaluation of AAV preparations. Mol Ther. 2017;25(6):1375–1386.

4. https://tieba.baidu.com

5. Bennicelli J, Wright JF, Komaromy A, et al. Reversal of blindness in animal models of leber congenital amaurosis using optimized AAV2-mediated gene transfer. Mol Ther. 2008;16(3):458–465.

6. Patrício MI, Cox CI, Blue C, Barnard AR, De Camara CM, Maclaren RE. Inclusion of PF68 surfactant improves stability of rAAV titer when passed through a surgical device used in retinal gene therapy. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020;17(June):99–106.

7. Reinauer EB, Grosso SS, Henz SR, et al. Algorithm-based liquid formulation development including a DoE concept predicts long-term viral vector stability. J Pharm Sci. 2020;109(1):818–829.

8. Evans RK, Nawrocki DK, Isopi LA, et al. Development of stable liquid formulations for adenovirus-based vaccines. J Pharm Sci. 2004;93(10):2458–2475.

9. Yao T, Zhou X, Zhang C, et al. Site-specific PEGylated adeno-associated viruses with increased serum stability and reduced immunogenicity. Molecules. 2017;22(7):1–15.

10. Mével M, Bouzelha M, Leray A, et al. Chemical modification of the adeno-associated virus capsid to improve gene delivery. Chem Sci. 2020;11(4):1122–1131.

Zhang C, Yao T, Zheng Y, et al. Development of next generation adeno-associated viral vectors capable of selective tropism and efficient gene delivery. Biomaterials. 2016;80:134–145.



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