基因治疗中高剂量AAV引起的炎症免疫毒性概述

近期，有三款基因治疗药物先后获批上市，分别是：（1）2022年7月21日，PTC Therapeutics 宣布其AAV基因疗法Upstaza™获欧盟委员会的上市许可，是第一个直接注入大脑的上市基因疗法。（2）2022年8月17日，美国食品药物监督管理局（FDA）批准了蓝鸟生物（Bluebird Bio）的基因疗法Zynteglo用于治疗β地中海贫血。（3）2022年8月24日，BioMarin Pharmaceutical 宣布，欧盟委员会批准血友病A的AAV基因疗法ROCTAVIAN™ (valoctocogene roxaparvovec) 有条件上市，用于治疗无FVIII 因子抑制剂史且AAV5抗体阴性的严重血友病A成人患者。至此，全球已有41款基因治疗药物获批上市（推荐文章链接：：汇总|截止2022年8月，全球已上市41款基因治疗药物）。此外，也有一些基因疗法出现严重副作用的报道，例如：（1）8月11日，两名儿童在接受诺华脊髓性肌萎缩基因治疗药物Zolgensma治疗后死于急性肝功能衰竭，死亡发生在俄罗斯和哈萨克斯坦，有专家推测可能是高剂量的药物导致了肝脏毒性（推荐文章链接：：诺华表示两名儿童接受Zolgensma治疗后死于肝功能衰竭，具体原因正在进一步调查中）；（2）8月17日，有报道称，意大利一名患有SMA的小男孩身上，他接受了基因疗法Zolgensma治疗后出现罕见且危及生命的综合征即噬血细胞性淋巴组织细胞增多症 (hemophagocytic lymphohistiocytosis，HLH)，其特征是在脊髓性肌萎缩症的基因治疗后过度免疫激活（推荐文章链接：Zolgensma治疗后出现首例危及生命的罕见免疫综合征病例，研究人员呼吁在进行基因治疗后对炎症标志物进行有针对性的监测）；（3）8月24日，诺华宣布，因发现可能存在严重副作用，决定暂停branaplam正在进行的亨廷顿病基因治疗IIb期临床研究。基因治疗的临床试验的结果不断重复着“乐观-失望”的反复循环，良好的治疗效果也会伴随着严重的副作用的风险，其中，AAV基因疗法临床中严重副作用多与AAV高剂量给药相关。

AAV基因治疗早期，基于同等剂量下对比AAV载体与第一代重组腺病毒（rAd）载体引起的免疫反应强度，人们判断AAV载体无明显免疫原性或免疫原性非常低。然而，首次给药AAV载体后，再次给药同种血清型AAV载体，会对再次给药的AAV载体产生较为强烈的免疫反应，表明第一次给药AAV，机体还是产生了针对AAV载体的明显的免疫反应（尽管相对腺病毒等载体免疫原性低），检测结果显示其中和（或结合）抗体由给药前的阴性转为阳性，表明AAV载体可以激活B细胞，产生针对AAV载体的中和（或结合）抗体；此外研究显示，免疫细胞可加工提呈AAV载体相关成分，激活特异性T细胞反应。影响AAV免疫反应的因素包括AAV载体的血清型、载体给药剂量、装载的治疗基因元件及其基因序列、给药途径、是否存在既往感染史，动物种属等。AAV基因治疗数据，尤其是临床试验数据提示AAV载体在低剂量给药时，免疫反应不强烈，但在高剂量给药时可能引起较为强烈的炎症免疫反应，对组织器官表现出毒性效应。此外，针对AAV载体及其治疗基因产物的免疫反应还会抑制其药效。

当AAV载体进入人体细胞后，体内抗原提呈细胞（例如DC、巨噬细胞等）经模式识别受体（例如TLR9、TLR2等）检测识别到AAV载体上的病原体相关分子模式，激活下游的相关信号通路，活化NF-κB等转录因子，启动炎症因子表达，刺激抗原提呈细胞的成熟，上调MHC及其一些共刺激因子的表达。当抗原提呈细胞迁移至淋巴结后，将AAV载体抗原肽提呈给淋巴细胞，致敏抗原特异性T细胞，激活特异性免疫反应。

早期由美国宾州大学主持进行的治疗血友病B的 AAV2 基因药物 I/II 期临床试验，证实AAV在人体内可引发严重的细胞免疫毒性反应, 高剂量给药组一名患者转氨酶水平急剧升高, 肝功能受到严重损害, 临床研究被迫终止。此研究中，患者经肝动脉输注装载人凝血因子Ⅸ基因的AAV2载体，分高中低三个剂量给药组，每组两位受试者。低中剂量给药组患者未出现明显毒副反应，但也未见药物疗效；高剂量给药组的两名患者中，一患者凝血因子Ⅸ水平在给药后两周内升至正常水平的3%，但在给药后第四周降至基线水平；另一位患者凝血因子Ⅸ水平升至正常水平的10%~12%，足以达到较好的疗效，但在给药后第四周，肝脏出现明显转氨酶升高。基于上述6位患者临床试验结果，将第 7 位患者的给药剂量降为中剂量, 也同样发生了转氨酶明显升高现象, 该临床研究随之终止。经排查未发现其他任何毒性或感染性因素, 也未检出针对转基因产物凝血因子Ⅸ的结合抗体。对第 7 位受试者的血液T 细胞研究显示, 上述毒性反应是针对AAV2 衣壳蛋白的细胞免疫反应，炎症因子IFN-γ的产生与AAV2 衣壳蛋白抗原肽直接相关。

在X-连锁的肌管肌病(XLMTM)基因治疗（AT-132）临床试验（ASPIRO trial，NCT 03199469）中，两名儿童死于药物副作用，据报道与高剂量AAV8载体衣壳引起的肝脏毒性有关，其肝毒性可能与针对AAV衣壳的免疫反应相关。此外，在AAV载体基因治疗其它临床试验中，接受高剂量全身给药AAV的患者中也出现了一些其他严重的不良事件（其严重程度不同）（见表1）。其副作用很大程度上是由于天然免疫反应(如炎症和补体激活)和特异性免疫反应所致。 

表1

一些临床前研究中也发现了AAV载体引发的炎症免疫毒性。之前有报道称，研究人员对恒河猴与仔猪给予了高剂量AAV9（2X10^14vg/kg）,在恒河猴和仔猪中都引发了明显毒性。给药后3只恒河猴都出现明显的转氨酶升高。有两个转氨酶升高后消退，没有临床后遗症，而有一个发生急性肝衰竭和休克，并且在注射AAV载体后4天被安乐死。此外，还观察到背根神经节感觉神经元的退化，但临床表现较轻。仔猪没有表现出肝毒性，但在AAV载体注射后的14天内，所有三只仔猪表现出感觉功能缺陷和共济失调，其行动能力严重受损，不得不对其进行安乐死，提示可能在引起感觉神经元缺陷上，猪比恒河猴更加严重。上述报道的炎症毒性反应可能与补体系统激活有关。随后，在一些患者中也观察到与上述动物实验中类似的炎症毒性。

尽管眼睛与中枢神经系统常被认为是免疫豁免部位，但有研究结果显示AAV载体直接给药眼部或中枢神经系统，仍会激发机体的炎症免疫反应。AAV被用于眼部基因治疗，其主要靶标是感光细胞（视锥细胞和视锥细胞）和视网膜色素上皮细胞（RPE）。尽管针对Leber先天性黑眼病2（LCA2）和脉络膜血红素等眼部疾病的临床试验已证明AAV基因疗法对人类安全，但无论大小动物模型，已发现AAV引起的眼毒性病例，具体情况取决于研究中使用的病毒载体元件或给药剂量：视网膜下注射AAV2- CNGA3显着导致绵羊中感光细胞和RPE的丧失以及淋巴细胞浸润，而注射AAV8- CNGA3则可以激活非人类灵长类动物的固有免疫反应和适应性免疫反应。去年的一篇报道称在小鼠模型中发现AAV载体中顺式调控序列与AAV诱导的毒性之间存在密切关系，此研究结果可以为基因治疗设计更安全的AAV载体；进一步分析发现AAV诱导的毒性与小胶质细胞活化和促炎细胞因子的增加有关。去年10月，诺华（Novartis）发布消息称美国FDA部分暂停了AVXS-101鞘内给药（intrathecal）的临床试验。诺华旗下的AveXis与卫生监管部门、临床试验研究者沟通了一项小型临床前研究的结果，在该研究中动物实验结果显示背根神经节 (DRG) 单核细胞炎症，有时伴有神经元胞体变性或丢失。此外，一些报道称，大剂量鞘内给药恒河猴后，脊髓背根神经节出现神经炎症综合征。另一项研究通过颅内直接给药AAVrh8，在食蟹猴上出现了明显的神经毒性（也有可能与其编码的目的蛋白过表达有关），尽管之前的研究结果表明在鼠、猫及羊等动物中进行的颅内注射AAVrh8载体药物，表现出了足够的安全性，表明AAV载体基因治疗在不同物种间的差异。表2列举了一些针对AAV载体的炎症免疫类别，与其对应的相关给药信息及应对策略。

表2

上述AAV基因治疗临床前及临床试验中，出现的或重或轻的炎症免疫相关的副作用，提醒人们要进一步加强AAV基因治疗的安全性研究，尤其针对AAV高剂量给药。在短期内，需要进行更多的临床前研究，以便更好地预测或了解更安全的给药剂量、毒性生物标志物，以及不完整衣壳水平、制造方法产生的杂质和不同纯化策略等参数对安全性影响。从长远来看，需要把注意力从“如何安全使用高剂量载体”转向“如何设计载体”，这样就不必使用高剂量载体，可以（或需要）在多个方面进行努力，包括：

（1）改造衣壳，使其能够更好地适应目标器官。

（2）改造启动子和组织/内环境调控元件。

（3）优化载体包装方法，同时能够满足生产需求，同时减少减少杂质。

（4）优化纯化方法，进一步减少杂质。

（5）提高对载体生产过程中AAV基础生物学的理解。

（6）更稳定的反向末端重复(ITR)基因组结构。

（7）避免免疫应答的新策略。

（8）优化给药方式或途径。

除了药物优化外，还必须考虑单单由体重来确定给药剂量是否合适。例如，两个体重相同的儿童，如果他们的疾病严重程度显著不同，是否应该给予相同的给药剂量？或者，经历过青春期的儿童与婴儿相比，目标器官的发育有差别，是否应该给予相同的给药剂量？或者患者的性别不同，是否应该给予相同的给药剂量？在许多人群中观察到AAV肝转导具有明显的性别二态性，男性表现出更高的肝转导。对于AAV转导的性别二态性问题，至少我们有一些研究数据可供参考。但对于不同发育状态和疾病严重程度的给药剂量问题，目前严重缺乏临床前的数据。

此外，AAV载体临床前动物实验毒理结果与人体临床试验可能存在明显差异。在AAV基因治疗领域，无疑需要通过进一步的研究（包括了解其机制）来解决上述毒性问题， 只有在对AAV高剂量毒性的机制有了更深入的了解后，才能为解决上述毒性问题设计出最佳的解决方案，使得AAV基因治疗安全性得到最充分的保障。尽管存在上述高剂量给药安全性问题，但众多的临床前试验及临床试验数据表明AAV载体无疑是高安全性的载体之一。

参考资料：

1. Flotte, Terence R. "Revisiting the “New” Inflammatory Toxicities of Adeno-Associated Virus Vectors." (2020): 398-399.2. Perez, Barbara A., et al. "Management of neuroinflammatory responses to AAV-mediated gene therapies for neurodegenerative diseases." Brain Sciences 10.2 (2020): 119.3. Novartis Announces AVXS-101 Intrathecal Study Update. Available online: https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-announces-avxs-101-intrathecal-study-update (accessed on 28 January 2020).4. Rabinowitz, Joseph, Ying Kai Chan, and Richard Jude Samulski. "Adeno-associated virus (AAV) versus immune response." Viruses 11.2 (2019): 102.5. Le Bras, Alexandra. "A look at AAV toxicity in the mouse." Lab animal 48.5 (2019): 142-142.6. Barnes, Christopher, Olivia Scheideler, and David Schaffer. "Engineering the AAV capsid to evade immune responses." Current opinion in biotechnology 60 (2019): 99-103.7. Hordeaux, Juliette, et al. "Toxicology study of intra-cisterna magna adeno-associated virus 9 expressing human alpha-L-iduronidase in rhesus macaques." Molecular Therapy-Methods & Clinical Development 10 (2018): 79-88.8. Hinderer, Christian, et al. "Severe toxicity in nonhuman primates and piglets following high-dose intravenous administration of an adeno-associated virus vector expressing human SMN." Human gene therapy 29.3 (2018): 285-298.9. Golebiowski, Diane, et al. "Direct intracranial injection of AAVrh8 encoding monkey β-N-acetylhexosaminidase causes neurotoxicity in the primate brain." Human gene therapy 28.6 (2017): 510-522.10. Corti, Manuela, et al. "Safety of intradiaphragmatic delivery of adeno-associated virus-mediated alpha-glucosidase (rAAV1-CMV-hGAA) gene therapy in children affected by Pompe disease." Human Gene Therapy Clinical Development 28.4 (2017): 208-218.11. Rogers, Geoffrey L., et al. "Unique roles of TLR9-and MyD88-dependent and-independent pathways in adaptive immune responses to AAV-mediated gene transfer." Journal of innate immunity 7.3 (2015): 302-314.12. 刁勇, et al. "重组腺相关病毒基因药物的细胞免疫毒性及对策." 药学学报 9 (2010): 1071-1077.

13. Manno, Catherine S., et al. "Successful transduction of liver in hemophilia by AAV-Factor IX and limitations imposed by the host immune response." Nature medicine 12.3 (2006): 342-347.

E.N.D

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