2022年8月基因编辑技术CRISPR最新研究及应用进展

从2013年首次宣布CRISPR-CAS9系统可以应用于哺乳动物开始，CRISPR技术因其高效率、易操作和低成本，正在基因编辑领域掀起一场新的革命。

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随着科学家对CRISPR系统研究的深入，各种基于CRISPR的DNA、RNA编辑工具和基因表达调控工具被逐渐开发与完善，并被大家期许将会在许多遗传性疾病的基因治疗中大展拳脚。本文带大家了解下8月份基因编辑技术重要研究及产业应用进展。

一、最新研究进展：

1、Nature Biotechnology：升级版基因编辑系统，效率翻倍，助力CAR-T疗法的高效制造

8月25日，加州大学旧金山分校研究团队的一项研究成果以题目“High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails.”发表于《自然》杂志的子刊《自然-生物技术》上，该研究发现了一种低毒性、高效、并且无需借助病毒的CAR-T细胞制造方法，科研人员开发了一种新型基因编辑方法，该方法以单链DNA（ssDNA）作为同源定向修复模板，其中包含了毒性较低的Cas9目标序列。相对于dsDNA的Cas9目标序列，其敲入效率和产量平均提高了约2-3倍（详见往期文章：升级版基因编辑系统，效率翻倍，助力CAR-T疗法的高效制造）。

2、Nature：领跑全球！邦耀生物全新一代Quikin CAR-T取得重大突破

8月31日，聚焦于基因和细胞治疗的上海邦耀生物科技有限公司（以下简称“邦耀生物”）宣布，与华东师范大学、浙江大学医学院附属第一医院合作的非病毒定点整合CAR-T技术（Quikin CART®）研究成果正式在国际顶级学术期刊Nature上发表。

Quikin CART®是邦耀生物搭建的具有自主知识产权的非病毒定点整合CAR-T平台，可在不使用病毒载体的情况下，通过一步制备获得基因组定点整合的CAR-T细胞产品，具有成本低、制备时间短、工艺简单、安全性和有效性高等优点。2020年5月，在浙江大学医学院附属第一医院开展了全球首个“PD1敲除非病毒定点整合CD19-CART细胞治疗复发难治性非霍奇金淋巴瘤的临床试验”，该产品体现出了出色的临床安全性和有效性，首例接受治疗的患者至今已疾病完全缓解(CR)超过2年。

Quikin CART®技术发明人，该论文第一作者、共同通讯作者，邦耀生物研发副总裁、华东师范大学生命科学学院副研究员张楫钦博士说：“近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术的不断成熟和发展让我们萌生了将其应用于CAR-T治疗的想法。通过对现有CAR-T技术的深入剖析以及对目前CAR-T治疗领域存在问题的系统梳理，我们意识到利用基因编辑技术来制备非病毒定点整合CAR-T细胞是一个具有巨大潜力的发展方向。我们通过大量的方法摸索和条件优化，建立了成熟的Quikin CART®技术平台（详见往期文章：领跑全球！中国CAR-T成果首登Nature，邦耀生物全新一代Quikin CAR-T取得重大突破）。

3、Nucleic Acids Research：发表新型RNA精准编辑系统

8月27日，中国科学院上海营养与健康研究所王泽峰团队在Nucleic Acids Research上，发表长文ProgrammableRNAbaseeditingwithasinglegRNA-freeenzyme。该研究报道了一种单一组分的新型可编程RNA单碱基编辑系统REWIRE（RNAeditingwithindividualRNA-bindingenzyme），可在人体细胞中实现高达60%-80%的A-to-I或C-to-U编辑。该系统利用一种人源PUF蛋白来靶向识别RNA序列。PUF蛋白包含一个RNA结合域，称Pumilio同源域或PUF域。RNA结合域通常由八套36个氨基酸的重复序列组成。每个重复序列上有三个氨基酸残基在和RNA的结合中具有重要作用。通过对可编程PUF结构域的设计和对其长度的优化，该系统可实现对8-10nt的目标序列精准定位高效编辑靶标的同时降低脱靶效应。

　　REWIRE系统及其优化策略

REWIRE提供了一种无需借助gRNA的单一人源蛋白组分RNA单碱基平台，其精确定位、低脱靶效应的特点为生命科学领域的研究带来更多可能。研究将REWIRE与已有的基于CRISPER/Cas的REPAIR编辑策略进行综合评比，指出REWIRE在脱靶率相当时的编辑效率具有明显优势，因而未来的应用前景更加广阔。目前，该研究团队在探索后续转化研究的可能，以期为一些目前临床需求迫切且尚无应对策略的遗传性疾病提供新的治疗思路。

4、Science：我国科学家开辟哺乳动物染色体编辑新领域首次全球实现哺乳动物完整染色体可编程连接

8月26日，国际学术期刊《科学》（Science）在线发表了中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院研究员李伟与周琪团队合作完成的研究论文（A sustainable mouse karyotype created by programmed chromosome fusion）。

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该研究在全球首次实现了哺乳动物完整染色体的可编程连接，并创建出具有全新核型（染色体组型）的小鼠（详见往期文章：中科院最新研究开辟哺乳动物染色体编辑新领域）。

5、Science：可爱龙团队揭示能够切割蛋白的新型CRISPR工具作用机制，有望提供新的抗病毒工具和组织工程工具

8月25日，美国康奈尔大学可爱龙实验室联合荷兰代尔夫特理工大学Stan J.J Brouns实验室，在Science期刊发表了题为：Craspase is a CRISPR RNA-guided, RNA activated protease的研究论文。

该论文报道了Craspase（CRISPR偶联的蛋白酶新系统，CRISPR associated Caspase）是一个gRNA引导靶向，并且受到靶向RNA激活的蛋白酶，该蛋白酶受到激活之后可以对天然的蛋白底物进行切割并诱导细胞死亡。在精准医疗新时代背景下，该工具有望引领出全新的精准医疗思路。

6、Nature：CRISPR-Cas9基因编辑系统R-loop形成和活化的结构基础

Cas9 是一种 CRISPR 相关的核酸内切酶，能够进行 RNA 引导的位点特异性 DNA 切割。Cas9 的可编程活性已被广泛用于基因组编辑，但其靶 DNA 结合和脱靶辨别的精准机制仍未完全了解。8月24日，来自瑞士苏黎世大学的Martin Jinek实验室在Nature发表题为R-loop formation and conformationalactivation mechanisms of Cas9的论文。

该研究解析了一系列酿脓链球菌Cas9 的冷冻电镜结构，捕获了靶 DNA 杂交的定向过程。在R环形成的早期阶段，Cas9 REC2 和 REC3 结构域形成一个带正电荷的裂隙以容纳目标DNA双链的远端。经过种子区的靶向杂交过程引发了REC2 和 REC3 结构域的重排和HNH核酸酶结构域的重定位，以呈现无催化能力的检查点构象。这些结果为Cas9的靶向DNA 依赖性激活建立了一个结构框架，揭示了其构象检查点机制，并可能促进新的Cas9突变体的开发，以及具有增强特异性和活性的向导RNA的设计。

7、Signal Transduction and Targeted Therapy：平渊团队开发双重特异性CRISPR/Cas纳米系统，用于肝脏疾病防治

8月12日，浙江大学药学院平渊课题组在Signal Transduction and Targeted Therapy期刊发表了题为：A dual-specific CRISPR-Cas nanosystem for precision therapeutic editing of liver disorders 的论文。该团队构建了一种双重肝脏特异性Cas介导的DNA或RNA编辑系统，为炎症性肝脏疾病的精准治疗提供了全新策略。

该研究中，该团队提出了双重特异性编辑的概念，即结合肝脏靶向递送和肝脏特异性编辑的双重功效，通过对肝细胞的相关基因或RNA进行精准编辑而调控炎症相关的信号通路，达到对炎症性肝病的有效防治。

8、Science：在微生物中首次发现新的防御系统：微生物STAND ATPase直接识别病毒蛋白，并杀死受感染的微生物细胞

8月12日，麻省理工学院和哈佛大学博德研究所张锋教授团队在 Science 发表了题为：Prokaryotic innate immunity through pattern recognition of conserved viral proteins（通过保守病毒蛋白模式识别的原核先天免疫）的研究论文。

该研究表明，在细菌和古菌（统称为原核生物）中，与真核生物NLR类似的先天免疫系统也很普遍，这些NLR样基因共有4个家族，是两个高度保守的噬菌体蛋白的特异性传感器。与目标结合时，这些NLRs激活不同的效应域，切割双链DNA，诱导细菌死亡，以防止噬菌体的传播。这项研究发现了细菌和古菌能够通过直接检测入侵病毒的关键蛋白并导致“自杀”，从而平息病毒在微生物群落中的传播，这也是首次在原核生物钟发现这种机制，该研究发现了涵盖了细菌、古菌和真核生物这三域的所有生命都在使用的病原体特异性识别模式。

9、Nature Biotechnology：基因编辑新突破：脑智卓越中心开发出特异性更高、安全性更好的高保真版Cas13系统

8月11日，辉大基因首席科学顾问杨辉研究员带领的课题在《Nature Biotechnology》发表题为“High-fidelity Cas13 variants for targeted RNA degradation with minimal collateral effects”的文章。该研究综合利用蛋白质改造工程、流式细胞术、体外切割实验、全转录组测序、转基因小鼠、在体基因治疗安全性验证等技术手段，对Cas13（包括Cas13d和Cas13X）进行蛋白工程化改造、筛选及验证，开发出了具有高效编辑活性但极低旁切活性的高保真Cas13蛋白变体，对基于RNA编辑的基础科学研究、基因治疗策略研发以及后续的临床转化具有重要意义（详见公众号往期文章：基因编辑新突破：脑智卓越中心开发出特异性更高、安全性更好的高保真版Cas13系统）。

10、Nucleic Acids Research：上海科技大学生命科学与技术学院高冠军组开发高效基因编辑工具TEd

8月5日，上海科技大学生命科学与技术学院高冠军课题组在学术期刊《核酸研究》 (Nucleic Acids Research)上发表研究论文Transcription-coupled donor DNA expression increases homologous recombination for efficient genome editing，报道了一种简单、高效的基因编辑方法“TEd”（Transcription-coupled Editor，TEd转录偶联编辑器）：通过在传统HR-供体(HR-donor) 上引入转录过程以改变DNA修复过程中的供体染色质结构状态来促进同源重组的发生，从而实现细胞内大片段DNA的高效编辑。近年来，CRISPR/Cas9及其衍生物介导的基因编辑技术的开发与应用已引起了全世界广泛关注。多种依赖于HR同源重组途径的基因编辑器已经能够实现DNA的精准插入或基因删除，这不仅促进了生物医学的基础研究，同时为多种遗传疾病的治疗带来了巨大的临床应用前景。然而在哺乳类动物细胞中对于长片段DNA（尤其是10kb以上）的精准插入或删除效率却非常低，严重阻碍了CRISPR技术在大片段基因编辑时的操作可行性。高冠军团队一直从事基因编辑技术的开发，早期研究试图在细胞中融合表达Cas9与RT逆转录酶，通过在HR-供体质粒上提供一个启动子来转录与同源DNA互补的RNA分子，然而此种依赖于RT逆转录酶在大片段基因敲入上的效率却很低。研究过程中偶然发现处于转录状态的HR-供体能显著促进同源重组修复，团队据此提出通过人工引入转录过程以期改变DNA修复过程中的供体与受体的染色质结构状态，从而验证HR-供体的结构状态改变是否可提高大片段DNA的插入和删除效率。

图A, 转录耦合编辑器TEd与CEd传统编辑方法差别。图B, 使用TEd系统的细胞中可以观察到有较CEd更多的环绕核膜的GFP荧光信号出现（LMNA-GFP整合），表明TEd系统可以更高效地在目标位点插入GFP标签。

基于这一推测，团队开发了一系列优化的TEd基因编辑系统，通过在同源供体质粒上引入启动子以形成TC-供体（Transcription-Coupled HR-donor），并在其转录产物TC-RNA的3’端添加多个MS2茎环结构，以及在Cas9上融合MS2适配体的结合结构域（MCP）。经验证，TEd系统在几种哺乳类测试细胞中的编辑效率相比传统CRISPR/Cas9介导的编辑方法（CEd）提高了10倍左右。TEd系统不仅解决了传统基因编辑方法效率较低的问题，还为将来在表观遗传学的层面探索DNA重组修复机制提供了良好的基础。

11、Nat Commun：CRISPR/Cas9基因编辑可能导致细胞毒性和基因组不稳定性

在一项新的研究中，西班牙巴塞罗那生物医药研究所研究员Fran Supek博士及其研究团队报告说，根据人类基因组的靶序列位点，CRISPR/Cas9基因编辑可以引起细胞毒性和基因组不稳定性。这种不想要的影响是由关键的肿瘤抑制蛋白p53介导的，并由编辑位点附近的DNA序列和周围区域的多种表观遗传因子决定。相关研究结果于2022年8月4日发表在Nature Communications期刊上，论文标题为“TP53-dependent toxicity of CRISPR/Cas9 cuts is differential across genomic loci and can confound genetic screening”。

利用计算方法，这些作者分析了为人类细胞设计的最受欢迎的CRISPR文库，并检测到了3300个显示出强烈毒副作用的靶序列位点。他们还报告说，大约15%的人类基因含有至少一个显示出毒副作用的编辑位点。Supek博士解释说，“我们的研究解决了与TP53相关的Cas9毒副作用的一个重要问题---也是最近有一些争议的问题，它也提供了如何回避这个问题的指南。避免在这些‘风险’位点上进行编辑，不仅会使CRISPR编辑更有效，更重要的是更安全。”一个特定的基因可以在不同的位点被编辑。论文第一作者、巴塞罗那生物医药研究所的Miguel-Martin Álvarez博士说，“基因中对调节很重要或有某些表观遗传标记的区域是最有可能触发p53反应的区域，因此，作为一般建议应避免使用。”

12、Nucleic Acids Research：天津工生所在维生素工业菌种基因编辑方面取得进展

中国科学院天津工业生物技术研究所研究员张大伟团队在苜蓿中华根瘤菌基因编辑方面取得进展，相关研究成果以“A versatile Cas12k-based genetic engineering toolkit (C12KGET) for metabolic engineering in genetic manipulation-deprived strains”于8月3日发表在Nucleic Acids Research。他们构建了一个不依赖同源重组的基因编辑工具（C12KGET，versatile Cas12k-based genetic engineering toolkit ) ，可以在苜蓿中华根瘤菌中实现基因组多基因编辑及大片段高效插入。10kb的大片段插入效率最高达100%。通过改造维生素B12的途径基因，维生素B12的产量得到明显提高。另外，Cas12k蛋白具有非活性的核酸酶结构域，可以直接用来对基因进行转录调控，效率可达92%。该工具也可用在大肠杆菌和希瓦氏菌属中，为其他内源同源重组效率低的物种提供借鉴。研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金和天津市合成生物技术创新能力提升行动的支持。 

高效基因整合示意图 

13、PNAS：刘志勇/陆发隆合作采用基因编辑技术揭示小鼠耳蜗调控听觉毛细胞发育新机制

8月5日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、神经科学国家重点实验室、上海脑科学与类脑研究中心刘志勇研究组与中科院遗传与发育生物学研究所陆发隆研究组合作在PNAS在线发表了文章Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development，（三个不同的Atoh1增强子协同调控声音受体毛细胞发育）。

该研究解析了新生小鼠耳蜗毛细胞的全基因组开放染色质图谱，发现和验证了两个之前未知的Atoh1增强子。研究利用CRISPR/Cas9技术敲除单个或同时敲除多个Atoh1增强子，揭示了Atoh1的三个增强子以剂量依赖性协同调控毛细胞发育。该工作为Atoh1表达的精准表观遗传学调控机制提供了更深入的理论依据，并为耳蜗毛细胞再生提供了新的潜在靶点。 

二、产业方面进展：

1、8月23日，Verve Therapeutics宣布，临床前实验研究支持将公司的第二款候选基因疗法VERVE-201推入临床开发阶段。VERVE-201是一款单碱基编辑基因疗法，通过对肝脏中胆固醇和甘油三酯代谢的关键调节因子ANGPTL3基因进行基因编辑，永久性关闭ANGPTL3的表达，以达到降脂目的。

2、8月15日，广州瑞风生物科技有限公司的HBG基因修饰的自体CD34+造血干细胞注射液临床申请获CDE受理（详见往期文章：国内首个新靶点地贫基因编辑创新药物IND申请获CDE受理）。

3、8月16日，上海邦耀生物科技有限公司的BRL-101自体造血干祖细胞注射液临床申请获CDE批准，用于治疗输血依赖型β-地中海贫血，BRL-101是基于邦耀生物自主研发的造血干细胞平台(ModiHSC^®)开发的基因治疗产品。ModiHSC^®主要是利用基因编辑系统对患者的造血干细胞进行基因修饰，修饰后的造血干细胞回输到患者体内，通过自我更新和分化重建修饰细胞群体，从而达到治疗血液系统疾病的目的。目前，邦耀生物利用自主开发的基于基因编辑技术的造血干细胞平台(ModiHSC^®)在治疗β0/β0型重度地贫患者在研究者发起的临床试验中已取得了良好的效果，全国范围内已成功帮助多例β地贫患者脱离输血依赖。（详见往期文章：官宣！邦耀生物β-地中海贫血基因疗法国内IND获批）。

4、8月15日，瑞风生物自主研发的β-地中海贫血RM-001体外基因编辑药物新药临床试验（IND）申请获得国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）受理（受理号：CXSL2200378）。RM-001是中国首个HBG新型靶点的基因编辑产品，用于治疗β-地中海贫血（详见公众号往期文章：国内首个新靶点地贫基因编辑创新药物IND申请获CDE受理）。

5、8月9日，中国国家药品监督管理局药品评审中心（NMPA）公示，四川康德赛医疗科技有限公司（以下简称“康德赛”）自主研发用于治疗晚期卵巢癌的个体化树突状细胞（以下简称“DC”）CUD002注射液临床试验的申请已受理（受理号：CXSL2200371国）。该产品为中国首款基于患者肿瘤新生抗原的mRNA编辑DC肿瘤疫苗。康德赛通过5年耕耘，建立了实体肿瘤的细胞免疫治疗平台CUNDE®。CUD002是该平台中第一个即将进入临床试验阶段的细胞产品，有望开拓国内实体肿瘤的细胞免疫治疗新疆域（破茧成蝶：康德赛mRNA编辑DC个性化肿瘤疫苗IND正式受理）。

6、8月12日，南京蓝盾生物科技有限公司的LD013自体T细胞注射液临床申请获CDE受理（详见公众号往期文章：蓝盾生物靶向间皮素CAR-T疗法IND获受理）。

7、8月11日，GraphiteBio宣布首位镰状细胞症（SCD）患者已经使用其基因疗法GPH101，现在被称为nulabeglogene autogedtemcel（nula-cel）。Nula-cel是一种研究性基因编辑疗法，旨在直接纠正导致SCD的基因突变并最终治愈疾病。公司预计在2023年年中报告CEDAR试验的初始概念验证数据。FDA曾授予nula-cel“快速通道”和“孤儿药”(Orphan Drug)称号用于治疗SCD。

8、8月4日，上海邦耀生物科技有限公司宣布，邦耀生物和中南大学湘雅医院合作的世界首例CRISPR基因编辑治疗β0/β0型重度地贫的患儿目前脱离输血依赖已超过2年，开启了正常生活和学习，同时该项临床试验成果今日发表在国际顶级医学学术期刊Nature Medicine（影响因子：87.241）。截至文章投稿时，两名患儿的胎儿血红蛋白分别从基线时的2.55g/L、1.75g/L分别上升至最近一次访视的149g/L和139g/L，总血红蛋白含量也分别达到了152g/L和140g/L，且在治疗后都实现了脱离输血依赖超过16个月。在整个治疗过程中，清髓预处理相关毒性较轻，未发生严重的感染，并分别于移植后52天和40天出院。两名患者的红细胞数量和总体血红蛋白水平在第45天左右开始稳定增加，在第75天左右达到健康水平。截至日前，两例受试者脱离输血依赖均已超过24个月（详见公众号往期文章：Nature Medicine重磅|邦耀生物地贫基因疗法BRL-101使患者脱离输血依赖超2年，公布详细临床数据）。

9、8月1日，FDA暂停Beam Therapeutics的CAR-T疗法BEAM-201的新药申请，目前FDA并没有指明临床试验暂停的原因。Beam-201是一种靶向CD7的同种异体CAR-T疗法，用于治疗复发/难治性急性淋巴细胞白血病（详见公众号往期文章：FDA暂停Beam公司基于碱基编辑的癌症疗法临床实验）。

10、8月1日，Cellectis宣布美国FDA已批准公司通用型靶向CD20和CD22双靶点CAR-T细胞治疗的IND申请，以启动UCART20x22的1/2a期临床试验，用于复发或难治性非霍奇金淋巴瘤（r/ r NHL ）患者。

E.N.D

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