升级版基因编辑系统，效率翻倍，助力CAR-T疗法的高效制造

8月25日，加州大学旧金山分校研究团队的一项研究成果以题目“High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails.”发表于《自然》杂志的子刊《自然-生物技术》上，科研人员开发了一种新型基因编辑方法，该方法以单链DNA（ssDNA）作为同源定向修复模板，其中包含了毒性较低的Cas9目标序列。相对于dsDNA的Cas9目标序列，其敲入效率和产量平均提高了约2-3倍，是一种低毒性、高效、并且无需借助病毒的CAR-T细胞制造方法。

该研究亮点如下：

01  科学家开发了一种新方法，可以产生足够的细胞用于治疗应用

CRISPR-Cas9基因编辑系统的新变体使得重新设计大量用于治疗应用的细胞变得更加容易。这种方法由格莱斯顿研究所和加州大学旧金山分校（UCSF）开发，使科学家能够以极高的效率将特别长的DNA序列引入细胞基因组中的精确位置，而无需传统上用于将DNA这是迈向下一代安全有效的细胞疗法的一大步。

在发表在《自然生物技术》杂志上的新论文中，资深作者Marson和他的同事们不仅描述了这项技术，还展示了它如何用于产生CAR-T细胞。

第一作者Brian Shy博士表示，“我们可以在 一次运行中设计超过十亿个细胞，这远远高于我们治疗单个患者所需的细胞数量。”

GLADSTONE和UC SAN FRANCISCO的一组科学家开发了一种使用CRISPR的新方法，用于生产大量用于治疗应用的细胞。

02  从双链DNA到单链DNA

CRISPR-Cas9是一种编辑活细胞内基因的系统，在过去十年中一直被用作基础研究工具。

通过基因编辑，人们可以关闭，删除或替换突变的致病基因，或增强免疫细胞的抗癌活性等。虽然CRISPR-Cas9的首批治疗应用最近已进入临床试验，但该技术仍然受到安全制造大量正确编辑细胞的挑战的限制。

传统上，研究人员依靠病毒载体 - 没有致病成分的病毒壳，将用于基因治疗的DNA（称为DNA模板）携带到细胞中。然而，制造大量临床级病毒载体一直是向患者提供细胞疗法的主要瓶颈。此外，研究人员无法轻松控制传统病毒载体在基因组中插入基因的位置。

2015年，Marson的团队与CRISPR先驱Jennifer Doudna博士的实验室合作，首次表明他们可以在没有病毒载体的情况下将短DNA模板插入免疫细胞中。到2018年，他们开发了一种用CRISPR将更长的DNA序列剪切和粘贴到免疫细胞中的方法。然后，在2019年，研究人员发现，通过使用可以与Cas9酶结合的DNA模板的修改版本-在CRISPR基因编辑期间充当分子剪刀的相同蛋白质——他们可以更有效地将新序列传递到靶基因组位点。

然而，需要更多的工作来提高成功工程免疫细胞的产量，并使该过程与未来细胞疗法的制造相容。这些目标激发了团队目前的研究。

DNA可以存在于单链或双链中，Cas9附着在双链DNA上。但研究人员发现，高水平的双链DNA模板可能对细胞有毒，因此该方法只能用于少量的模板DNA，导致效率低下。

而单链DNA对细胞的毒性也较小。因此，在新论文中，他们描述了一种将修饰的Cas9酶附着在单链模板DNA上的方法，方法是在末端添加一小段双链DNA。

与旧的双链方法相比，单链模板DNA的基因编辑效率可以提高一倍以上。“这项技术有可能使新的细胞和基因疗法更快，更好，更便宜。“

03  通往临床的道路

在这项研究中，研究人员使用新的DNA模板产生了超过十亿个靶向多发性骨髓瘤的CAR-T细胞。CAR-T细胞是经过基因改造的免疫T细胞，可有效对抗特定细胞或癌症。使用新的单链Cas9定向模板，大约一半的T细胞获得了新基因，转化为CAR-T细胞。

“将DNA模板靶向基因组中的特定位置，称为TRAC位点，将提高CAR-T细胞的抗肿瘤效力“ ，这种新的非病毒方法使我们能够更有效地实现靶向，这将加速下一代CAR-T细胞疗法的开发。“

此外，研究人员表明，他们的方法可以首次完全取代与罕见遗传免疫疾病相关的两个基因，IL2RA和CTLA4基因。

过去，科学家们已经证明他们可以替换IL2RA基因的一小部分，其中特定患者有突变。现在，Marson的团队证明，他们可以一次替换整个IL2RA和CTLA4基因 - 一种“一刀切”的方法，可以治疗许多基因中具有不同突变的患者，而不必为每个患者的突变生成个性化模板。用这种基因工程方法治疗的近90%的细胞获得了健康的基因。

研究人员现在正在寻求批准，以推进在CAR-T细胞疗法和IL2RA缺乏症治疗中使用非病毒CRISPR技术的临床试验。

E.N.D

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