处于“十字路口”的基因治疗，将何去何从？

在现代生物医学技术时代，医学领域在预防、诊断和治疗包括遗传异常在内的致命疾病方面取得了较大进步。然而，由于基因水平的改变，许多遗传疾病及生命进程中获得的疾病无法用常规的药理制剂、生物制品和基于多肽的方法达到治疗效果[1]。随着新的治疗方式的发展，治疗策略除了可以消除疾病的表型症状外，还具有从根源上调节致病因素的潜力。值得关注的是，基因治疗是一种强大的工具，其在基因水平上通过控制疾病中的基因变化来纠正疾病；旨在治疗各种人类疾病，包括显性和隐性遗传疾病、癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等。近期，有三款基因治疗药物先后获批上市，分别是：（1）2022年7月21日，PTC Therapeutics, Inc.（纳斯达克股票代码：PTCT）宣布其AAV基因疗法Upstaza™获欧盟委员会的上市许可，是第一个直接注入大脑的上市基因疗法。（2）2022年8月17日，美国食品药物监督管理局（FDA）批准了蓝鸟生物（Bluebird Bio）的基因疗法Zynteglo（betibeglogene autotemcel，beti-cel）用于治疗β地中海贫血。该疗法在美国的获批上市对处于财务危机的蓝鸟生物无疑是“雪中送炭”。（3）2022年8月24日，BioMarin Pharmaceutical公司（BioMarin）宣布，欧盟委员会批准血友病A基因疗法ROCTAVIAN™ (valoctocogene roxaparvovec) 有条件上市，用于治疗无FVIII 因子抑制剂史且AAV5抗体阴性的严重血友病A成人患者。至此，全球已有41款基因治疗药物获批上市（详见往期文章：汇总|截止2022年8月，全球已上市41款基因治疗药物）。近期，也有一些基因疗法出现严重副作用的报道，例如：（1）8月11日，两名儿童在接受诺华脊髓性肌萎缩基因治疗药物Zolgensma治疗后死于急性肝功能衰竭，具体原因正在进一步调查中，死亡发生在俄罗斯和哈萨克斯坦，有专家推测可能是高剂量的药物导致了肝脏毒性（详见往期文章：诺华表示两名儿童接受Zolgensma治疗后死于肝功能衰竭，具体原因正在进一步调查中）；（2）8月17日，有报道称，意大利一名患有SMA的小男孩身上，他接受了基因疗法Zolgensma治疗后出现罕见且危及生命的综合征即噬血细胞性淋巴组织细胞增多症 (hemophagocytic lymphohistiocytosis，HLH)，其特征是在脊髓性肌萎缩症的基因治疗后过度免疫激活（详见往期文章：Zolgensma治疗后出现首例危及生命的罕见免疫综合征病理，研究人员呼吁在进行基因治疗后对炎症标志物进行有针对性的监测）；（3）8月24日，诺华宣布，因发现可能存在严重副作用，决定暂停branaplam正在进行的亨廷顿病基因治疗IIb期临床研究。基因治疗的临床试验的结果不断重复着“乐观-失望”的反复循环，良好的治疗效果也会伴随着严重的副作用的风险。

基因治疗

基因治疗主要通过插入、敲除或纠正针对治疗的突变基因来改善基因的功能[2]。包括抑制基因表达、人为过表达或基因修饰。如RNA干扰(RNAi)、反义寡核苷酸(ASO)、微核糖核酸(MiRNA)、小干扰核糖核酸(SiRNA)以及短发夹状核糖核酸(ShRNA)可在mRNA水平抑制基因表达(转录后基因沉默)[3,4]。基因的过表达则是通过直接递送靶标基因(以质粒DNA形式)进入细胞(基因替代疗法)的方式实现特异性蛋白的表达，这种方式促进了疾病中异常或缺乏的蛋白质的短暂或持久的补充。纠正性基因治疗主要是指利用基因工程手段（如CRISPR/Cas9基因编辑技术）对细胞的基因组序列进行靶向修饰，达到改变靶标蛋白表达效果的目的。

基因治疗的分类（图片来源：生物经纬）

为了使基因治疗取得成功，必须选择一种安全有效的方法将发挥作用的DNA递送至靶细胞或组织中。理想的基因治疗载体应该具有较高的转导效率，能够诱导靶基因长期稳定的表达，具有足够的能力携带递送大量的转基因，对靶细胞具有特异性，能够转导成熟和增殖的细胞，同时避免随机插入和突变[5]。具有不同特性的不同矢量被用于不同的应用。最常见的递送载体类型是病毒载体，它可以有效地将所携带的基因递送到宿主细胞。与非病毒载体相比，病毒载体的优势包括递送效率高、装载能力强和特异性高，这一系列的优势促使病毒载体成为基因治疗递送的主力军[6]。

Various methods of gene therapy [7]

基因治疗临床发展历程

19世纪初，“基因”开始了基因治疗工具这一基础阶段的发展。1990年，WilliamFrench Anderson （威廉·弗兰奇·安德森）开展了第一个获准用于人类的基因疗法临床试验，并取得成功；这对于科学界、患者和制药公司而言，都是一个激动人心的时刻，标志着基因治疗从概念变成了现实，向临床转化的成功迈进。经过最近20年的发展，全世界已有超过10款基因疗法上市，用于治疗癌症、病毒感染、遗传性疾病等等，将人类带入了基因治疗的新纪元；同时在这一时期，新的基因技术如CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展，为基因治疗的发展装上了“加速器”。根据之前的临床试验和目前批准的产品，基因治疗这一前景看好的医药领域似乎比以往任何时候都进展得更快，并且正在逐步将基因疗法拓展到更广泛的疾病的治疗中。

Historical timeline of gene therapy [8]

基因治疗现状

近期，一连串的挫折让这一领域重新回到了现实。在2022年5月于Nature Biotechnology 所刊发的短篇评述中，对目前病毒载体开展的基因治疗所面临的困境进行了回顾复盘[9]。

去年的一项分析报告称，在149项AAV基因治疗临床试验中，平均有35%在治疗过程中出现了严重不良事件。今年2月，杰富瑞所发布的报告中提到，在2021年期间被暂停40%的临床试验是属于细胞和基因治疗这一领域。其中，主要出现的问题为AAV递送治疗过程中的安全性；AAV是一类单链线状DNA缺陷型病毒，因其具有高效的转导能力、非整合性以及能特异性感染各组织器官，已被作为一种安全有效的病毒载体用于基因治疗的临床试验。然而，在AAV递送的临床试验中存在着注射剂量导致的肝毒性；在低剂量(10¹⁰-10¹¹vg/kg)下，AAV主要用于局部递送到眼睛、耳朵等组织，或用于分泌蛋白或编码抗体的(例如血友病)直接递送。而针对于脑深部结构、运动神经元和肌肉等组织，AAV的注射剂量则需要达到2×10¹³-3×10¹⁴vg/kg这一较高的剂量。截止到目前为止，AAV所引起的毒性的原因尚不清楚，猜测可能是由于高剂量AAV携带的目的基因的过表达造成细胞代谢应激反应，或在体引起的免疫原性。除此，AAV诱导的癌症也是一个令人担忧的问题；有相关报道，经AAV递送基因治疗的新生小鼠患上了肝细胞癌(HCC)；在血友病犬的长期AAV递送治疗过程中观察到所携带的治疗性基因存在被整合到生长相关基因的附近，存在诱发癌症的可能。

慢病毒载体可作用于细胞周期的G0/G1期，整合到宿主基因组中，从而实现了转基因的稳定和长期表达。虽然整合到宿主基因组中确实有其好处，但也存在插入突变的固有风险；即慢病毒最大的优点和它最大的缺点是硬币的正反面，无法分割。比如，在去年8月，FDA暂停的蓝鸟生物的Lenti-D慢病毒基因疗法在3期临床试验中，在一名患者中出现了骨髓增生异常综合征。

基因治疗出路

针对上述提到病毒递送载体所引起的副作用，研究者们也逐渐在调整优化递送方式。通过设计病毒衣壳来解决这些问题；通过合理的设计、相关序列重建或衣壳文库的分子进化模拟等方式可增强对靶组织的递送效率、改善中和抗体的躲避或增加病毒滴度的效果。除此，一些融合病毒载体的开发也逐渐被关注，如将细胞外囊泡与AAV相结合来达到躲避免疫系统攻击的目的。考虑到380万亿种病毒生活在我们体内外，人们对探索人类病毒体以寻找AAV和慢病毒以外的新型载体的兴趣越来越大；如可以躲避免疫反应的人类共生型Anellovirus病毒载体，将基因装载量提高至5.2kb的复合型BocaVirus/AAV杂交载体，及刘如谦课题组开发的递送基因编辑器的工程化类病毒颗粒递送载体（Engineeredvirus-like particles，eVLP）等。

除此，纳米颗粒也是基因治疗中最常用的非病毒载体之一，在这类载体中用作遗传元件载体的材料有具有多样性。如壳聚糖（可生物降解的阳离子多糖）作为一种非病毒载体耐受性好，几乎没有免疫原性或细胞毒性。其已作为递送载体在多种器官系统中进行了测试，如眼睛、胃肠粘膜、肝脏及神经退行性疾病的基因治疗递送等[10]。另一类基因治疗的非病毒载体是外泌体，外泌体是细胞中天然存在的膜包裹的囊泡，对许多细胞过程非常重要，包括遗传物质的运输。目前，外泌体已被用于几个基因治疗实验，用于治疗软骨损伤和骨关节炎、癌症、心血管疾病[11]。外泌体可以与其他基因治疗提供方法相结合，例如AAV。一项研究表明，在遗传性耳聋的小鼠模型中，使用外显子相关的AAV将LHFPL5传递到耳蜗毛细胞的可能性，这导致了听力的部分挽救[12]。同一项研究表明，外泌体相关的AAV比单独的AAV更有效地将GFP报告基因传递到耳蜗毛细胞。

Fate of the gene delivery vectors [11]

展望

基因治疗，来到了领域发展的十字路口。然而，我们仍然坚信，目前所遇到的挫折及问题在世界上科学家的不懈努力下，会逐一被攻破，为基因治疗的发展指明方向，为相关疾病治疗带来新的曙光。

参考资料：

[1]E. Valeur, etal.New modalities for challenging targets in drug discovery, Angew.Chem.Int. Ed. (2017) 56 (35): 10294–10323.

[2]H. Wu, etal.Pharmaceutical Biotechnology: Fundamentals and Applications, SpringerInternational Publishing, Cham. (2019), pp. 323–355

[3]W. Xu, etal.RNA interference technology, Compr. Biotechnol. (2019) 5:560–575.

[4]A. Khurana, etal.Yttrium oxide nanoparticles reduce the severity of acute pancreatitiscaused by cerulein hyperstimulation, Nanomedicine. (2019) 18:54–65.

[5]R. Goswami, G. etal.Gene therapy leaves a vicious cycle, Front. Oncol. (2019) 9: 297.

[6]S. Ghosh, etal.Viral vector systems for gene therapy: a comprehensive literaturereview of progress and biosafety challenges, Appl. Biosaf. (2020) 25:7–18.

[7]Parambi DGT, etal.Gene Therapy Approach with an Emphasis on Growth Factors: Theoreticaland Clinical Outcomes in Neurodegenerative Diseases. Mol Neurobiol.(2022) 59(1):191-233.

[8]Arabi F, etal.Gene therapy clinical trials, where do we go? An overview. BiomedPharmacother. (2022) 153:113324.

[9]Gene therapy at the crossroads. Nat Biotechnol. (2022) 40(5):621.

[10]Jayakumar R, etal.Chitosan conjugated DNA nanoparticles in gene therapy. CarbohydrPolym. (2010) 79:1–8.

[11]Cring MR, etal.Gene therapy and gene correction: targets, progress, and challengesfor treating human diseases. Gene Ther. (2022) 29(1-2):3-12.

[12]Gyorgy B, etal.Rescue of hearing by gene delivery to inner-ear hair cells usingexosome-associated AAV. Mol Ther. (2017) 25:379–91.

E.N.D

更多精彩内容，点击下方视频号

为促进细胞与基因治疗领域的合作交流，更好的服务广大读者朋友，微信公众号“细胞与基因治疗领域”团队组建了专业的细胞与基因治疗行业交流群（涉及DNA药物、RNA药物和细胞治疗等方面），长按下方二维码，添加小编微信进群。由于申请人数较多，添加微信时请备注：院校/企事业单位名称—专业/职务—姓名。如果您是PI/ 教授/主管及以上职务，还请注明。

往期文章推荐：

声明：本文旨在知识共享，所有内容仅学术交流研究，不构成任何建议。