AAV制备工艺面临的挑战及应对策略（1）
腺相关病毒（AAV）因其良好的安全性、靶向性及转染率，已成为基因治疗领域最重要的基因载体之一。然而，与重组蛋白类药物相比，AAV病毒载体的生产是一个更加复杂的过程，病毒载体生产纯化存在生产工艺放大难，纯化难，稳定性差等一系列问题与挑战，有必要对病毒载体生产过程过程中影响其质量的因素及其相关机制做深入理解。
本文就AAV载体生产制备过程中遇到的挑战进行全面的分析，为广大工艺开发人员勾勒出了一幅提升病毒载体生产制备效率和提高产品稳定性的路线图。
AAV载体制备工艺流程图
（来源：BiotechnologyJournal (2021): 2100219）
整个AAV载体制备的工艺流程可以大致分为3个部分：上游培养、下游纯化和成品包装。其中上游培养和下游纯化中，涉及了更多的生产步骤、技术更加复杂，这里我们将做重点探讨。
一、上游培养：
AAV上游培养主要包括4个步骤：①质粒的生产制备；②产病毒细胞的扩增；③质粒的转染；④发酵产病毒。
（1）质粒的生产制备：
质粒是生产AAV的起始材料，通常在重组大肠杆菌发酵过程中获取。质粒的生产制备又可分为：发酵、菌体的收集、菌体的裂解、固液分离、澄清、层析以及浓缩等过程。与科研实验不同，产业化生产需要更加关注关键的工艺步骤，这将直接影响到最终质粒的产量与质量：
（a）细菌发酵所需的氧气：供氧不足会导致细菌代谢异常，质粒的稳定性降低，开环质粒的比例及质粒的聚集程度都会提高。在高密度菌体发酵培养中（高密度菌体发酵有利于提高单位体积培养体系中质粒的产量），系统的供氧效率显得尤为重要。因此，在质粒大规模发酵系统中，供氧效率的提升或优化对质粒产率的提升具有很大的意义。
（b）碱裂解：目前质粒大规模纯化工艺中，裂解菌体广泛采用的是碱裂解法，作为质粒纯化工艺中的关键步骤，非常容易出现问题。比如：pH控制不好，局部碱性过高会导致质粒遭到不可逆的破坏。防止局部碱性过高的方法之一是高效的混合方式，但混合也不易太过剧烈，一方面是因为高的剪切力会导致细菌基因组DNA断裂成小片段DNA，混进纯化的质粒中，造成污染，另一方面也会对质粒造成损伤，导致开环或线性质粒占比提高。此外，裂解的时间也是非常重要的，裂解时间过短，菌体裂解不充分或者细菌基因组变性不充分，给质粒纯化的后续步骤增加了难度和不确定性，裂解时间太长，会导致质粒遭到不可逆的破坏。
（c）层析纯化：作为目前大规模质粒纯化常用的方法，市场上商品化的大多数填料主要针对的是蛋白质，而非质粒DNA，而尺寸上看，质粒DNA比蛋白质大，无法进入大多数填料孔径内，这就会导致填料对质粒的吸附性能下降。另外，质粒的纯度是大规模生产中面临的主要挑战之一，通常层析法纯化得到质粒DNA质量要求是纯度大于95%且无工艺相关杂质的GMP级质粒DNA。值得一提的是，一些新型层析填料也已经被开发了出来，例如Cytiva公司新开发出的CaptoCore 700，其填料微球外表面是5μm 惰性外壳，可将700KD以上的大分子排阻在外，直接流穿。此外，该填料作为一款复合模式填料，融合了分子筛层析、离子交换层析和疏水层析三种模式，PH适用范围更广，填料清洁再生后，可多次重复使用，降低了成本。
（2）产病毒细胞的扩增：
目前被广泛使用的HEK293细胞贴壁培养技术，常常被用于实验室里生产小剂量的病毒，简单的操作，可满足大多数情况下的科研需求。但将其应用到AAV的大规模的制备的话，就略显不足了，例如，贴壁细胞的处理更加复杂，容易造成培养过程中的污染，以及难以监测和调节培养条件，如氧浓度、pH等。微载体培养技术在一定程度上解决了贴壁细胞的某些上述不足，工艺放大相对容易。而悬浮无血清细胞培养系统，如：HEK293、SF9等，使得AAV生产的工艺放大更为容易，且为AAV下游纯化减少了负担。这主要是因为动物来源制品（例如牛源血清），成分过于复杂，且很多成分被视为病毒载体产品的污染物，需要在后续AAV制备纯化工艺过程中予以去除，进一步增加了后续病毒纯化工艺的负担。更为严峻的是，其中一些潜在的病毒类微生物成分在大小和一些理化性质上与病毒载体类似，纯化难度极大。因此，在细胞培养系统中采用非动物来源、成分更明确的培养基，可显著降低外源污染物污染的风险。
（3）质粒转染：
目前，包装AAV最常用的转染系统包括：三质粒转染（贴壁或悬浮细胞）系统和杆状病毒（昆虫细胞）生产系统等。转染效率较低、质粒DNA的制备成本和转染试剂成本较高是AAV载体生产面临的最大挑战。
目前有多种质粒转染的方法，但都有各自的局限性。例如，利用磷酸钙进行的转染，其试剂纯度和pH敏感性会导致AAV生产在批次间存在显著差异。脂质体转染效率相对较高且细胞毒性较低，但试剂费用昂贵，特别是在AAV规模化的生产中。目前AAV规模化生产中使用最广泛的转染试剂是聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine，PEI）又称聚氮杂环丙烷，其主要的优势是价格便宜，但对细胞具有一定毒性，且对pH的变化敏感。此外，在三质粒转染悬浮细胞培养系统中，质粒分配比例的不平衡也会导致转染效率低下，进一步可导致空衣壳的比率具有明显的批次差异。构建衣壳基因序列及其它生产相关基因序列稳定整合的AAV包装细胞系统，也许是理想的解决手段之一【1】。
二、下游纯化：
下游纯化主要是指从病毒制品料液中去除杂质，得到纯化后的病毒颗粒。近些年，研发人员开发了多种AAV下游纯化方法。典型的纯化流程包括：
（1）破碎细胞：小的实验室规模制备常常采用反复冻融、超声处理等方式，而大规模的生产制备，常采用化学法（表面活性剂、有机溶剂等）破碎细胞，将病毒载体从细胞中释放出来；
（2）去除游离核酸：由于裂解细胞后，细胞内的宿主DNA、RNA及其它游离DNA等核酸被释放了出来，需要用核酸酶将这些核酸杂质消化去除，在去除这些杂质的同时，也会进一步降低细胞裂解后料液的粘度，有利于后续的纯化过程；
（3）料液的澄清：一般在进一步纯化前需要对细胞裂解后的料液进行澄清，往往是通过离心或膜微滤等方法去除细胞碎片等杂质；
（4）粗纯：层析去除宿主细胞蛋白(HCPs)和培养基血清蛋白等杂质；
（5）中度纯化：层析进一步去除主要杂质；
（6）精纯：最后，层析去除微量杂质并拿到最终纯化产品。
AAV下游工艺成本大概占据了总成本的60%左右，因此，一种高效、可重复的下游生产工艺流程显的尤为重要。下游工艺中面临的主要挑战有：细胞裂解、微滤及层析纯化，其中，最大的挑战当属于在层析纯化过程中针对AAV空壳病毒的去除。
（1）细胞裂解：如上所述，细胞裂解法，包括机械法和化学法，反复冻融方法在实验室小规模AAV载体制备中常用，但是难以扩大用于AAV规模化生产。机械均质法，靠机械剪切力破碎细胞释放出AAV，虽然这种方法可应用于AAV规模化生产，但由于其剪切力引起的聚集和沉淀往往会导致产品损失。采用表面活性剂TritonX-100作为细胞裂解的方法在AAV病毒载体纯化过程有较多的采用，这种方法很容易应用于AAV的规模化生产中，但根据最近的研究显示，TritonX-100处理过的病毒制品会导致一些诸如导致眼睛损伤、口腔毒性及皮肤刺激等生理毒性，随之被欧洲化学机构列为需高度关注的物质(SVHC)。因此，针对AAV工艺中的细胞裂解过程，现有方法的优化或是新方法的开发就显得尤为重要了。为了解决这个顾虑，Cytiva公司曾提供过一个解决方案：使用0.5% Tween 20+ 20U/mL Benzonase+1mM MgCl2的配方，在生物反应器中37℃培育4h，并充分混合，可在不影响细胞裂解效率的同时，有效降低生理毒性。
（2）微滤：细胞裂解产生大量的细胞碎片，很难通过传统死端过滤的方式去除，而切向流过滤（TFF）技术则是利用泵促使液体流动方向与过滤方向呈垂直进行过滤，就可有效避免堵塞的发生，在AAV下游工艺中得到广泛应用。此外，在微滤过程中，剪切力过大会导致AAV颗粒聚集或失活，而中空纤维材料可以有效减少剪切力的产生，在AAV生产中具有明显优势。
（3）层析纯化：典型的层析方法包括亲和法和离子交换层析(IEC)，其中亲和层析的产量及产率都较高，但它不能区分空壳病毒的和实心病毒。此外，亲和层析最大的挑战之一是，该方法特异性较高，不同AAV血清型需要不同的层析填料，成本较高。
此外，在下游纯化过程中，缓冲液对于AAV活性和产量具有重要的影响，选择合适的缓冲液，尽量减少衣壳蛋白的物理和化学降解（如聚集、蛋白质水解、氧化和脱酰胺化）显得尤为重要。在后续文章“AAV制备工艺面临的挑战及应对策略（2）”内容中，我们将针对缓冲液对AAV稳定性的影响及其改进策略展开详细讨论。
（4）空衣壳AAV的去除：空衣壳由于完全缺乏基因组物质，或者只包含基因组的某些片段，但在纯化性质上与目标产物极其相似（空衣壳和完整病毒粒子的电荷和大小相似），因此被认为是最难以去除的杂质。此外，空衣壳对于最终产品的免疫原性具有潜在影响，将直接影响AAV载体产品的有效性和安全性。去除空衣壳杂质的两种常用方法包括氯化铯密度梯度离心法和阴离子交换色谱法(AEX）。氯化铯密度梯度离心法是早期开发的一种纯化AAV的方法，并不适合用于AAV规模化生产。目前更多使用离子交换层析（IEC）来分离去除空壳AAV，在IEC中，空衣壳和完整病毒粒子衣壳在层析出的峰上有明显的重叠，这意味着要完全消除空衣壳AAV，就必须牺牲部分完整病毒粒子，进一步降低了AAV的产量。此外，使用的洗脱条件，如极端的pH和高电导率，这些条件会导致AAV衣壳受损，也对填料的要求更高，这也是一个亟需解决的问题【2】。
综上所述，本文概述了AAV载体生产制备上下游过程中遇到的多种挑战，并提出了一些应对策略。在下一篇“AAV制备工艺面临的挑战及应对策略（2）”文章中我们将重点分析影响AAV稳定性的多种因素及其相关的机制，并提出一些应对策略，为广大工艺开发人员勾勒出一幅提升病毒载体生产制备效率和提高产品稳定性的路线图。
在下一篇“AAV制备工艺面临的挑战及应对策略（2）”文章中，我们将针对缓冲液对AAV稳定性影响及其改进策略展开详细讨论，敬请关注！
参考资料：
2. Srivastava, Arvind, et al. "Manufacturing challenges and rational formulation development for AAV viral vectors." Journal of Pharmaceutical Sciences (2021).
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