荧光定量PCR仪器设置

荧光定量PCR仪的设置

以常见的ABI 7500为例介绍荧光定量PCR仪介绍进行荧光定量实验时软件的设置过程。

基本信息的设定

打开仪器的配套软件后，界面如下图所示，点击New Experiment新建一个实验文件。

在下方的基本信息栏中输入本次实验的名称（自定义），其余信息可以不填。

根据实验的内容选择具体的实验方案。

样品孔设置

点击软件界面左侧的Plate Setup进入样品孔设置界面。

在右侧的界面中输入待测基因和样品的名称，之后点击Assign Targets and Samples进入聚体样品孔设置页面。

根据实验的具体情况，在进行实验之前应首先设计各个样品孔所对应的样品及目的基因的配置方案，根据配置方案用鼠标选择样品槽中相应的样品孔，之后在左侧勾选其对应的目的基因和样品名称。

如为未知样品选择蓝色的U，阴性对照选择灰色的N。

如本次实验是绝对定量，则点击橘色框内的Define and Set Up Stardards打开标准曲线设置页面，并根据下图设置标准曲线。

运行方法的设置

设置完样品孔信息后，点击左侧栏内的Run Method进入运行方法设置页面。

根据所用定量PCR试剂以及引物对应的退火温度设置具体的运行方法，并将反应液的体积改为实验的实际体积，注意要在退火阶段检测荧光，确保退火阶段的荧光检测按钮处于激活状态。

通常默认的运行方法页面在扩增循环阶段只有两个温度选项，此时可以选中该阶段，点击上方的Add Step，选择After，增加72℃的延伸阶段。

荧光定量PCR仪器不支持设置多个退火温度，如不同的目的基因退火温度不同，只能分别进行实验。

通常情况下，熔解曲线的方法不需进行更改，如默认页面不显示熔解曲线过程，可以点击上方的Add Stage，增加熔解曲线，如无法增加熔解曲线，请返回第一步，检查实验方法是否选择正确。

实验保存和运行

在完成上述设置后，点击软件上方工具栏的Save按钮以保存实验文件，之后将配置后的反应体系加入仪器的样品槽后，点击绿色的START按钮开始进行实验。

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基本分子生物学实验系列

• 核酸提取

• 核酸质量检测

• 目的基因PCR和克隆

• 荧光定量PCR

• 荧光定量PCR的仪器设置