Nature：肠道菌群代谢物调节肠道与免疫
随着肠道菌群研究的不断深入，极大的革新了人们对于肠道菌的看法。17年11月22日上线的Nature文章，讲述了肠道菌群到底是如何影响肠道免疫系统的健康。
我们吃饭的时候，不仅仅只是填报自己的肚子，同时还养活了肠道中不计其数的肠道菌群。在过去的15年中，研究人员发现，肠道微生物产生的代谢产物可以改变人们的各种健康问题，例如糖尿病、心脏病和抑郁等。
最近Nature和Science更是连发数文，研究了肠道菌群对高血压等疾病的影响。刊登在《Nature》上最新的一篇研究阐述了肠道菌群代谢可以影响肠道的免疫健康。
在现代科学研究中，我们了解到，人类的身体内部存在着数以千亿计的微生物，然而这些微生物是怎么和人类共存的，现在正成为科学研究中的一大热点。于2017年11月22日发表在英国《自然》杂志上的一篇文章，来自斯坦福大学医学院的研究人员发现通过阻断生孢梭菌降解色氨酸的功能，小鼠血液中一种特定的分子（吲哚丙酸）的水平受到了影响，同时导致小鼠的免疫系统、肠道生理等也出现了差异。这篇文章从分子水平深入的解释了单菌的代谢途径及其产生的次级代谢产物对宿主的影响，这项研究工作给通过基因工程和合成重组微生物菌群的方法来改变肠道菌群提供了可能，提供了一种新的治疗手段；从理解肠道微生物和宿主在分子水平上的关系以及基因工程改造肠道微生物提供新的治疗方式等方面来讲，都具有重要的意义。
肠道微生物菌参与芳香族氨基酸代谢所产生的次级代谢产物对宿主的肠道与免疫健康的影响
Dodd, D., et al. (2017). “A gut bacterial pathway metabolizes aromatic amino acids into nine circulating metabolites.” Nature.
摘要
人类肠道微生物菌群可以产生多种次级代谢产物并在血液中积累，并且对宿主会产生系统性的影响。即使产生的这些小分子在宿主血液中的浓度可以达到和服用药物一样的水平，但是很少知道是哪些微生物在控制这一代谢过程去调控这些次级代谢产物的产生，从而影响宿主。然而，这篇文章中利用小鼠模型描述了肠道微生物菌群产生的多种次级代谢产物可在血液中积累，并结合遗传学和代谢组学解析了肠道中这一特定微生物——生孢梭菌利用芳香族氨基酸的代谢途径；结果显示这一代谢途径产生了12种化合物，其中的9种是已知的可在宿主血液中积累，同时，发现3种芳香族氨基酸(色氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸)都是作为底物去参与这一代谢途径的。通过基因工程改造生孢梭菌，在无菌小鼠中人为的调控代谢产物在血液中的浓度水平，发现产生的吲哚丙酸浓度的改变会对肠道的通透性以及系统免疫产生影响。这项工作从分子水平证实了肠道细菌是如何通过生物合成的途径对宿主肠道的通透性以及免疫健康产生影响，同时给基因工程改造肠道微生物提供了可能。
背景介绍
已有很多研究报道，肠道微生物的构成和组份的改变与宿主的生理以及人类的疾病相关，但是，很多的研究工作都只是强调了相关性，相对较少的一部分工作是从分子机理上阐述微生物与宿主的相互作用。然而，肠道微生物对宿主的作用其中一方面贡献是通过肠道中微生物产生的小分子次级代谢产物，通过循环系统来作用于人体的各个部位（Nicholson, J. K. et al. 2012;），甚至产生的这些次级代谢产物在血液中的浓度可以达到或超过药物剂量可以达到的水平；在很多情况下，这些由微生物产生的化合物的作用受体是特异的，并且可以调控宿主体内的稳态。然而，这里还是有3大核心挑战去建立微生物的代谢与宿主的健康之间的关系以及在分子水平上的联系。第一，解析这些代谢产物有哪些生物学活动，包括他们和人类疾病的联系；第二，弄清楚产生这些代谢产物的代谢途径，并在基因水平上预测与代谢物的产出；第三，利用解析出来的结果进一步结合基因工程和合成生物学去重编程这些由肠道微生物生产出的代谢物。
这篇文章分析了生孢梭菌（与肠道共生的一种菌）利用芳香族氨基酸的代谢途径，这种肠道微生物中一个特定的细菌（生孢梭菌，厚壁菌门）可以降解色氨酸，并分泌代谢产物吲哚丙酸；然而，吲哚丙酸会在血液中积累，其在血液中的浓度水平在生物体内可以有很大的变动范围（W. M. & Crouch, D. J. et al. 2003;），同时根据已有的研究表明，吲哚丙酸可以加固肠壁（Venkatesh, M. et al. 2014;），以及吲哚丙酸还被发现可被作为神经保护的活性分子（Chyan, Y. J. et al. 1999;）。正是因为吲哚丙酸在生物体内有这么多可能的生物功能，加上在肠道中吲哚丙酸的产生还是未知的，所以引起研究者们的兴趣，从分子水平深入的去了解吲哚丙酸的产生以及其对人类健康的作用。
正文
之前的研究表明少数的细菌，包括生孢梭菌和肉毒杆菌可以降解色氨酸产生吲哚丙酸（Wikoff, W. R. et al. 2009; Elsden, S. R. et al. 1976;）；这些细菌也代谢苯丙氨酸和酪氨酸产生PPA和4-OH-PPA（Elsden, S. R. et al. 1976;），生孢梭菌介导的还原苯丙氨酸代谢反应已经被研究清楚，同时大部分的参与PPA产生的代谢中间酶也已被生化鉴定（Dickert, S. et al. 2000; Dickert, S. et al. 2002;），而在这个代谢途径中最关键的步骤是苯乳酸脱水反应后转化为t-肉桂酸，是由异三聚体脱水酶（FldABC）催化的。根据已有的文献报道，都是利用芳香族氨基酸为底物，同时在代谢过程中产生的中间产物也可能相同，所以文章的作者大胆的假设产生IPA的代谢途径和产生PPA的代谢途径中是存在相同的代谢过程，都需要脱水酶去催化这一复杂的代谢途径。
因此，对生孢梭菌的基因组进行分析，BLAST查找在生孢梭菌中可以催化产生吲哚丙酸的同源脱水酶基因（图1A），系统发育树是针对BLAST FldC（取BLAST出来的前100个同源较高的基因）建立的，但是只是找到吲哚乳酸脱水酶是与FldC同源性最高，然而与FldC差异还是非常大的，因此他们通过找FldC的同源基因的方法失败了。所以，文章的作者推断他们更有理由假定苯乳酸脱水酶就参与了产生IPA的代谢途径。苯乳酸脱水酶的保守的gene clusters如下所示；这些基因参与了苯丙氨酸代谢途径中的还原反应。文章作者选择性的破坏fldC编码的蛋白亚基（苯乳酸异三聚体脱水酶），通过插入ClosTron cassette（Heap, J. T. et al. 2010）来实现的。为了研究清楚这种突变会对生孢梭菌产生的影响，文章的作者就在基本培养基（包含10种必须氨基酸，按标准浓度控制）中培养了野生型和突变体生孢梭菌。
图1. 苯基丙氨酸代谢还原途径基因定位于一个保守的基因簇
观察野生型和突变体在生长过程中的差异，其生长速率都是呈指数生长，但是发现野生型生孢梭菌达到2倍数量的时间花了82±2 min，而突变体生长达到2倍数量所需时间是160±10 min；然而在基本培养基中加入葡糖糖之后，野生型和突变体在生长趋势上无明显差异。同时，通过液相色谱-串联质谱(LC-MS)鉴定检测PPA，4-OH-PPA和IPA在野生型和突变体中的产生的差异，发现在野生型中的这些次级代谢产物的量要远高于在突变体（几乎不产生PPA，4-OH-PPA和IPA）中，以上结果直接证明了fldC对芳香族氨基酸还原代谢是必要的，并且提供了直接的遗传学证据证明了产生IPA的代谢途径和产生PPA的代谢途径是有相同的部分。
图2. 肠道菌群还原芳香族氨基因的代谢途径
然而，在上述的培养基中包含了10种必需的氨基酸（其中包含了芳香族氨基酸），分别将三种芳香族氨基酸用于培养野生型生孢梭菌和突变型生孢梭菌，LC-MS检测到野生型中可产生PPA，4-OH-PPA和IPA，然而突变型中几乎没有产生这些代谢产物，并且通过加入不同的底物，来检测野生型和突变型生孢梭菌在产生芳香丙酸酯的差异，图2e结果显示FldC的作用是在转氨作用和还原反应起始步骤的下游。以上结果显示fldC在产生PPA，4-OH-PPA和IPA的代谢途径中是必需的，并且共享一个途径，其中苯乳酸脱水酶作用在这个共享途径中是倒数第二步作用（图2f）。生孢梭菌是在肠道微生物中唯一的至今被发现可以产生吲哚丙酸（IPA），既然已经研究得到在生孢梭菌中产生IPA的基因，文章作者提出问题是否其他的肠道中的微生物也具有产生IPA的能力，为了解决这个问题，文章作者从HMP得到40种分离出来的微生物菌，主要关注厚壁菌门的菌，因为还原芳香族氨基酸(AAA)代谢途径，还未在其他菌门中报道过。基于RpoB蛋白序列进行系统进化分析法，将选取的40种菌系分成了8个科。然后，将这些单菌分别置于RCM培养基（强化梭菌培养基）中培养，并且上清用液相色谱-四极杆-飞行时间质谱进行分析。结果显示，被培养的40种单菌中36种菌在RCM培养基中生活下来，但是31种菌中都没有检测到芳香丙酸酯，然而发现有4个新菌系（Peptostreptococcus anaerobius CC14N和3个Clostridium cadaveris菌系）可以产生IPA（图2h），但是从系统进化分析上显示与生孢梭菌的差异还是很大的（图g2），然后对这4个可以产生IPA的新菌系的苯乳酸脱水酶的基因或同源基因与生孢梭菌中保守的与产生IPA相关的基因序列进行对比，发现C. Botulinum中调控产生IPA的基因序列与野生型生孢梭菌的基本共线性，然而，C. difficile中负责调控产生IPA的gene cluster与生孢梭菌的gene cluster几乎不一样；文章的作者认为，根据结果分析，可以得出其实产生IPA的过程比之前想象的要更为简单一些。
为了进一步解析AAA代谢途径，文章作者接下来分别构建了四个生孢梭菌突变体（porA, fldH, acdA, fldZ），并且假设这四个基因都与AAA代谢途径中的氧化反应或还原反应相关进行实验，在附图 3-7中进行了直接证明了：fldH, acdA, fldC在三种芳香族氨基酸的还原AAA代谢途径中都是必需的，porA在苯丙氨酸和酪氨酸的氧化AAA代谢途径中是必需的，fldZ可能在还原AAA代谢途径没有作用。
图3. 代谢组研究表明AAA代谢途径中共有的和特有的特征
在这项研究中，研究者们进一步探索野生型生孢梭菌与突变体生孢梭菌会对生物个体产生什么样的影响，所以建立了小鼠模型，给无菌小鼠接种野生型和吲哚丙酸缺陷型突变体的生孢梭菌，粪便微生物菌群结果分析显示，野生型细菌和突变体定殖是没有差异的；然而，接种野生型生孢梭菌的小鼠血液中吲哚丙酸的含量可达80uM，接种fldC缺失突变生孢梭菌的小鼠血液中吲哚丙酸含量检测出来低至8nM。文章的最后，简单的描述了一下和免疫系统的关系，研究者们发现吲哚丙酸浓度的下降会导致免疫细胞数量的上升，包括中性粒细胞，单核细胞，记忆T细胞等。并且，与接种野生型生孢梭菌相比较，接种fldC缺失的突变体生孢梭菌的小鼠，其肠道的通透性更大，易引发小鼠肠道炎症反应。
图4. 肠道菌群调节小鼠血清中代谢物水平，改变宿主免疫活性和肠道通透性
基于这一研究成果，Justin L. Sonnenburg认为可以通过调控人体内微生物菌群的组成和结构，从根本上改变新陈代谢去治疗或者预防疾病，而不是简单的补充某类化合物（如本文章中提及的：吲哚丙酸）。
热心肠导读
Nature：首次明确肠道特定细菌代谢特定氨基酸的产物
标题：肠道细菌代谢芳香族氨基酸生成9种循环代谢产物
① 对产芽胞梭状芽胞杆菌代谢芳香族氨基酸的代谢通路进行遗传及代谢分析；② 该代谢通路可产生12种化合物，其中9种可在宿主血清中积累，有3种仅由细菌产生；③ 所有3种芳香族氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸）均可作为该代谢通路的底物；④ 通过对产芽胞梭状芽胞杆菌进行遗传学修饰，并将其定殖于无菌小鼠体内，可调节这些代谢产物的血清水平，并影响肠道通透性及系统性炎症；⑤ 未来或可通过调节肠道细菌的代谢通路治疗疾病。
主编评语
这是Nature杂志刚刚上线的重要文献，通过生物信息学工具，分析出梭状芽胞杆菌代谢芳香族氨基酸的代谢产物，发现其中9种可进入体循环，并行使重要的生理作用。这是针对特定细菌对氨基酸的代谢的重要基础性研究工作，对理解哺乳动物与菌群的共代谢机制具有重大意义，值得认真读一读！
Reference
Dodd, D., et al. (2017). “A gut bacterial pathway metabolizes aromatic amino acids into nine circulating metabolites.” Nature. https://www.nature.com/articles/nature24661
Nature：首次明确肠道特定细菌代谢特定氨基酸的产物 http://www.xunludkp.com/papers/read/1033711360?kf=mobile.search
Nature长文：肠道菌群到底如何影响免疫系统 https://www.yiliaohui.com/detail_23685.html
Nature：“神奇分子”，有效改善人类免疫系统健康! http://www.medsci.cn/article/show_article.do?id=6870121226e7
肠道菌群分泌药物分子可调节肠道与免疫系统健康 http://www.sohu.com/a/206347607_99997099
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