PNAS: 儿童生长发育迟缓 = 长期饥饿？
本文转载自“态昌基因”，己获授权
写在前面的话
今天，小昌没有表情包，没有段子，有的只是来自残酷的现实的叩问和来自科研工作者无奈的叹息！
当今饥饿似乎离我们日行渐远，珍馐佳肴拂手来，纸醉金迷知几许！殊不知偏国内一隅，仍有同胞日再食，褴褛衣衫，不合身的衣服遮不住他们羸弱的身躯，唯一让人难以忘记的是他们一双双毫无杂质的大眼睛…
今天再提《饥饿的苏丹》，并非小编悲天悯人。而是呼吁大家，多关注青少年儿童的健康成长，也是守护我们的未来。
By 一本正经的小昌
儿童的生长发育迟缓与胃肠道的菌群的“去分区”和口咽细菌的过度生长有关
Guide
当今，0-5岁的儿童容易罹患发育迟缓的症状（stunting）。全球约有1.55亿儿童发育不良，约占全世界儿童的25%。世界卫生组织（WHO）界定儿童发育迟缓具有严苛的标准，一般使用标准年龄别身高的z值（height-for-age z-score）的2倍标准差作为评判，低于该年龄段同龄人身高平均的两倍标准误差即被认为是发育迟缓。
更多资料请参考：
http://www.who.int/childgrowth/standards/h_f_a_tables_z_boys/en/
发育迟缓通常被认为是长期营养不良的结果，包括日常能量摄入的不足以及微量元素的缺乏。再者，由于患者居住环境的影响造成反复的肠内感染以及免疫力低下等等。慢性营养不良与重要的病理生理紊乱有关，包括增加对疾病的易感性，减少对口服疫苗的反应，延迟或减弱运动神经发育。
遗憾的是，生长发育迟缓的病理生理机制依旧未知，我们依旧缺乏有效的预防或治疗方案。近年来，一种被称为小儿环境性肠病(pediatric environmental enteropathy , PEE)的综合征出现，被认为是发育迟缓的根本原因。PEE即为小肠的慢性炎症，具有绒毛迟钝和肠内膜渗透性增加的特点。小肠细菌的过度生长（SIBO)同样会导致PEE，由此导致营养不良。这种过度生长会导致局部炎症，导致小肠“渗漏”屏障，以及消化和吸收功能受损。
在儿童PEE患者中都伴随着SIBO出现。过去的研究中的大多数使用氢或乳酸呼气测试来诊断SIBO是否存在。然而，在实际研究中，肠内细菌对患者摄入的糖发酵会导致呼吸中的氢增加。同时这种方法也没有提供任何关于SIBO群落组成的信息。我们无法找到与SIBO相关的细菌群落，引起与PEE有关的SIBO的病理的细菌种类仍然是难以捉摸的。
目前我们仍然缺乏与发育迟缓和PEE相关的肠道菌群的清晰证据。
Significance
本研究中，研究人员比较了马达加斯加（Madagascar）和中非共和国（Central African Republic）的儿童的小肠，胃液以及粪便样本，基于16S高通量测序和可培养技术鉴定出与PEE相关的菌群，描述了发育不良儿童小肠积液的微生物组成。
√发现这些儿童受小肠细菌过度生长的影响，并有一个以口咽细菌为主要特征性微生物群落
√在80%以上发育不良的儿童中发现了SIBO，并发现SIBO主要由通常存在于口咽腔内的细菌控制。
√这种标识菌群也反映在粪便样本中，且并没有受到国家地区差异的影响；
√发育迟缓通常被认为是由反复的肠内感染引起的。而本研究则表明口咽类群与发育迟缓有关，提示可能涉及其他病理生理机制。
注：两个儿童发育迟缓患病率最高的非洲国家（0-5岁儿童近乎一半都患有该症状）
Design：
患病与正常身高的儿童小肠积液，胃液，粪便样本；
设计因素：国家，性别，年龄，患病状态，SIBO；
Results：
结果一：粪便样本与小肠样本的群落组成差异较大
胃和十二指肠样本聚类较好但与粪便样本明显分开，不同样本间微生物组成显著不同。一些幼儿的胃部和小肠样本根据国家进行聚类；
胃、十二指肠和粪便样本在OTU水平上的丰富度[Chao1]大致相同；
粪便样本相比小肠和胃样本，其均匀度显著降低，表明粪便中有优势类群，十二指肠和胃中分布较为均匀；
核心的菌群（至少在90%的全部样本中出现，且相对丰度在每个样本中至少大于0.01%)表现为：相比于粪便样本，胃和小肠样本具有更多的类群。这意味着在OTU水平上，上消化道可能比下消化道表现出更保守的结构。
胃和十二指肠样本共享43个OTUs，而上消化道标本(胃、十二指肠)却仅共有3个OTUs。这些均表明上消化道和下消化道的细菌微生物区系是明显的。
点评：
中规中矩的分析思路！先观察不同样本类型的群落结构，检验分组效应；然后观察群落组成，分析优势菌群分类；再以丰富度多样性指标为切入点，引入核心菌群，从各个方面分析不同样本类型之间的关联。
思考：如何在检验某一分组效应时排除其他因素的影响？
结果二：胃、十二指肠和粪便群落的α-Diversity不受发育迟缓状态的影响，而是取决于年龄和国家来源。
胃、十二指肠或粪便样本的丰富程度不受患病状况的影响；我们进一步调查了这些儿童的原籍国或他们的年龄是否会对群落结构产生影响；
事实上，年龄稍大的儿童比年龄稍小的孩子有更丰富、更均匀的粪便微生物群，国家对群落均匀性无总体显著影响。
马达加斯加具有较小程度的、更加多样性的群落丰富度；
如果样本按年龄分层，这种趋势在3岁或3岁以上的儿童中变得显著；
在线性混合模型中证实了国家和年龄对总体丰富度的贡献，以及样本类型对总体均匀度的贡献
点评：
本研究最大的难度在于如何区分不同的分组效应，由于本研究样本存在的分组过多，且分组间极有可能具有重叠。我们若仅仅采用传统的统计方法分析，势必会导致结果偏差。而作者却使用线性混合模型，排除外界干扰因素（如送样时间）的影响，单独检验某一因素的pure effort。这点值得大家在分析时多多注意。
换个思路，连续变量到分类变量再到二元变量，看看你的结果是否还保持一致！
若涉及因素较多，推荐大家多考虑分组分层分析，这样也能保证不漏掉任何关键信息。
结果三：发育不良儿童的小肠菌群中口腔菌富集而导致小肠细菌过度生长（SIBO)
从CAR和马达加斯加共分离出47个不同的菌落；链球菌、葡萄球菌、嗜血杆菌、奈瑟氏菌、莫拉克氏菌和罗思氏菌是最主要的菌属；
通过对十二指肠样本进行16S扩增子测序分析，证实了培养鉴定的细菌分类群的存在，以及口腔咽部腔内常见的细菌属的高普及率。
整个群落结构，特别是最常见的类群，在属级和种级上，在这两个国家非常相似；
在中度发育迟缓和重度发育迟缓的儿童之间也非常相似；20个最常见的类群贡献了群落中总丰度的一半以上(58%)。
它们包括一些口腔起源的分类群，包括四种嗜血杆菌属不同的种（流感嗜血杆菌, 副溶血性弧菌，埃及嗜血杆菌，未培养的嗜血杆菌）；三个不同的奈瑟氏菌属物种（N. cinerea, N. lactamica, uncultured Neisseria）；口腔链球菌；两种韦永氏球菌属物种，非培养的卟啉单胞菌属，克拉罗氏菌属；
十二指肠样本的SIBO组成与胃部样本具有惊人的一致性，并且共有较高比例的核心类群
与十二指肠样本类似，胃部样本主要由口咽部细菌类群所组成，
当按区域分层时，十二指肠和胃的样品组成无明显差异，说明pH对菌群组成并无影响？；
点评：
由于高通量测序仅仅得到菌群相对丰度，而在本研究中，我们需要了解到SIBO，小肠菌群的过度生长状态，我们可通过纯培养的方式计算菌群含量（CFU），适用于菌株纯培养及应用，但缺点是准确度较低。也可通过定量PCR的技术计算其生物量。
结果四：发育不良的儿童粪便中有明显的特征：比例过高的口腔细菌和肠道致病菌而且丁酸盐的产生不足
几个分类群的丰度与发育状态有关，这些包括一些在口咽腔中发现的分类群；例如，链球菌属，卟啉单胞菌，奈瑟菌，梭杆菌，维利菌，芽孢杆菌，或放线菌。这些类群同样也作用于SIBO。
通过对物种水平（OTUs）的分析，可以识别出一些标记为“口咽类群”，这些标识物在发育不良的儿童中比对照组更为丰富；例如，唾液乳酸菌、Prevotella histicola、黑色普氏菌、牙周梭杆菌、副溶血性杆菌等；
潜在的肠病原菌（大肠杆菌志贺氏菌和弯曲杆菌）在发育不良儿童中也比对照组更为普遍。
营养不良的儿童相比对照组来说有多个类群丰度降低。包括其中包括产丁酸梭菌的许多成员；
当正常与中度发育不良或严重发育不良的儿童进行比较时，无论是来自两国的合并数据或是各自的分层数据，都发现了口咽菌群的过度表达。
虽然在十二指肠样本中都有一些每个国家特有的菌群。但在这两个国家，十二指肠中口咽菌群的患病率始终很高，而在发育不良和正常体重的儿童的粪便中患病率较低。
与对照组相比，发育不良儿童的粪便中涉及到丁酸盐代谢的基因往往不那么普遍；但没有显著差异；产丁酸细菌的丰度差异最大的是在CAR中发育迟缓的样本中；
丁酸代谢的变化可能反映了产丁酸微生物的差异，尽管程度较轻。
总之，我们描述了发育不良儿童粪便中的保守特征，包括口咽分类群和肠致病菌的增加，反映了同一儿童小肠液体的群落组成。
注1：对粪便样品微生物组成影响最大的因素是年龄、发育迟缓和区域因素，因此，我们需要矫正来自年龄，区域或者相应的因素进行分层，同样矫正性别因素的影响；
注2：丁酸盐是一种高热量的营养物质，是宿主代谢的有效调节剂。因此，它的长期消耗可能导致营养不足。此外，丁酸盐是兼性厌氧肠致病菌(如伤寒沙门氏菌)定殖抗性的效应物；
点评：
作者的描述略显繁琐，但分析思路却是较为清晰。物种组成和功能基因丰度都沿用由总体到分层的思路。作者期望找出粪便与小肠和胃液样本变化较为一致且标识明显的菌群，以此用粪便特定标识菌来指示发育迟缓和PEE。从整体寻找差异，再到分层验证。
结论：
1）发育不良儿童的SIBO的组成，以口咽物种为主要特征；
2）发育不良儿童的胃和十二指肠中具有类似的微生物群
3）在发育迟缓的儿童粪便中，具有以致病菌过度表达以及在SIBO中多种口咽菌存在的特征；
模型假设：
发育不良的儿童会经历胃肠道的分解，使口腔内的微生物类群或通过粪-口污染引入的微生物类-群，更容易在胃和十二指肠中定居。
这些口咽菌和病原体通过胃肠道从胃到结肠，最终可在粪便中检测到，作为SIBO和发育迟缓的标志。
重要的是，在小肠中口咽部细菌的过度生长可能导致了PEE特有的小肠炎症和损伤，这一假设值得进一步研究。
局限性：
本研究虽然从横向设计的思路能够适当的评估几个区间生态位的菌群组成。但值得注意的是，发育迟缓本身是一种慢性综合症，沿时间轴的纵向设计可以让我们评估口咽源菌群与发育迟缓之间的因果关系。
且本研究的测序深度较低，可能有一部分丰度较低的类群难以检测到。
此外，本研究中所用到的口腔核心菌群是来自数据库中的物种，并非是实验中得到的。
参考文献：
Vonaesch P, Morien E, Andrianonimiadana L et al. Stunted childhood growth is associated with decompartmentalization of the gastrointestinal tract and overgrowth of oropharyngeal taxa. PNAS 2018. doi:10.1073/pnas.1806573115
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