Science-2018-微生物群落的构建过程具有趋简性

标题Emergent simplicity in microbial community assembly

期刊Science, 2018

第一作者Joshua E. Goldford

通讯作者Alvaro Sanchez

作者单位Department of Ecology and Evolutionary Biology, Microbial Sciences Institute, Yale University, New Haven, USA

编译

张照婧

功能相似的物种互换

自然条件下，细菌混合形成存在相互作用的微生物群落。了解微生物群落在各种环境中如何构建并保持稳定性是非常重要的。Goldford等人从土壤和植物中提取了包含数百到数千个物种的微生物群落，进行16S rRNA测序，并利用数学方法建模。结果表明，特定条件下形成的稳定群落，尽管在粗略的分类模式上相似，但物种组成发生了显著变化，并且通过菌群结构能够预测实施实验的特定条件。

             摘要

在自然群落研究中，能否通过基本定量原则来解释和预测观测到的复杂分类结构，是微生物组研究中一个尚未解决的重要问题。生态过程的多重性阻碍了桥接理论和实验，同时影响着自然生态系统中的群落构建。本文从土壤和植物中采集到含数百到数千种微生物群体，并在良好可控的基本培养基中培养，通过监控微生物群落的构建过程来解决这一问题。结果表明，得到的稳定群落尽管在物种水平上发生巨大的变化，但是在菌群水平的功能以及粗略的分类水平上都是高度可预测的，并且受到营养有效性的控制。通过推广经典生态模型包含广泛的非特异性交叉互养 (cross-feeding)，本研究发现这些特征都是大型微生物群落构建的突现特性，从而解释了它们在自然生物群落中的普遍性。

前言

从动物发育以及宿主健康到生物地球化学循环过程，微生物群落都发挥着关键作用。快速进展的DNA测序技术能够以高分辨率映射这些群落的组成。这促使人们越来越关注控制微生物群落构建和功能的生态机制。为了设计合理有效的调控微生物群落定向发展的策略，需要对微生物群落生态学进行定量和预测性的理解。

对从海洋到人体等各种生态环境中微生物组的研究，已经揭示了微生物群落中存在的经验模式，包括：微生物多样性高，同一功能类群内有多个密切相关物种共存，稳定功能仍伴随着大量物种更替，以及在营养有效性与不同系统发育水平的分类组成相关联时存在不同程度的决定性。这些观测结果都表明了微生物群落构建中存在共同的构建原则。然而，微生物构建理论的缺乏阻碍了对这些经验结果的解释，并且目前仍然不知道微生物表现出的哪些功能和结构特征能够反映宿主或微生物组水平上的特定局部适应性，以及哪些是复杂的自构建微生物群落的通用特性。

将理论和实验联系起来以理解微生物构建的研究，通常依赖于对少数物种实施自下而上(bottom-up) 的实验。尽管这种方法有助于理解相互作用的特性机制，但目前尚不清楚这些研究结果能在多大程度上预测大型微生物群落的普遍特性以及其中的相互作用。值得注意的是，关于竞争和促进的相对贡献的持续争论，以及对高阶交互作用在微生物群落构建中发挥的作用知之甚少。为了超越经验观测的结果并将微生物构建的统计模式与生态学理论联系起来，需要在高度可控并易于理解的条件下对大量的多物种微生物组的构建过程进行研究，从而在理论和实验之间进行适当的比较。

结果 1

以复杂的土壤和植物共生菌群为蓝本，在单一碳源条件下反复传代培养，直至形成稳定的微生物群落。

本研究采用了一个高通量的非原位培养方案，将从自然环境中 (土壤以及植物叶片) 采集的生态稳定群落在良好可控的条件下 (含有单一碳源的基本合成培养基) 培养，并监控这些微生物群落的自发构建过程 (图1A)。从这些环境中采集的微生物组具有高度多样性以及丰富的分类，物种数在110~1290的范围内。首先将12个初始微生物组接种到以葡萄糖为唯一碳源的新鲜培养基中，并进行传代培养。每次传代转移的同时进行16S rRNA扩增子测序，分析群落组成 (图1A)。通过高分辨率序列去噪来识别ESVs (exact sequence variants)，代表了物种水平上的群落结构。

大约经过60代后，大多数群落达到稳态，几乎所有实验组均达到稳定的菌群平衡 (图1B)。对于12个初始生态系统，发现大型多物种群落在稳定后，10000条reads中含有4-17个ESVs，这是对群落中物种数量的保守估算。通过培养方法确定了扩增长测序产生的分类排布，包括代表性群落中所有优势菌属的分离和表型特征。

图一

细菌群落的自上而下构建。(A) 实验方案：从12个叶片和土壤样品中获得大量微生物集群，并在以葡萄糖为唯一碳源的合成培养基中进行连续的稀释培养。每次转移后，通过16S rRNA测序分析细菌群落结构。(B) 从第二次接种后，对代表群落 (每个稀释循环，约7代) 的结构分析揭示了包括肠杆菌、拉乌尔特拉、柠檬酸杆菌、假单胞菌和寡养单胞菌等5个菌属组成的群体。12个起始接种样品经过84代之后群落组成，在准确的序列变异水平 (C) 以及科分类水平 (D)，主要汇聚到肠杆菌科以及假单胞菌科的特征部分。(E) 起始接种液与传代实验结束后的微生物群落结构的单形表示方法。(F和G) 每个样品设置8个实验重复。微生物群落在科分类水平的分布发生聚集 (G)，而在属和种水平上显示出特征变化 (F)。

结果 2

这些群落尽管在种水平上存在一些差异，但是在科水平上非常接近，起源各异的群落其最终物种结构组成却十分相似，表现出复杂群落构建中的趋简性。

监控良好控制的环境中稳定微生物群落的构建过程有助于探索群落组成的构建机制。在物种 (ESV) 分类水平上，12个初始群落形成了高度可变的群落组成 (图1C)。然而，当以更高的分类等级对ESV进行分组时，发现具有高度多样性差异的12个初始群落，在科分类水平上，形成了具有相似结构的群落，主要以肠杆菌科和假单胞菌科为主 (图1D)。换句话说，尽管具有不同的起源，但所有群落在科分类水平出现了相似的结构。而对于菌属水平上的分类结构进行比较时，结果并非如此。

为了更好地理解科分类水平下分类变量的起源，12个起始微生物组悬浮液均设置了8个重复，并在葡萄糖培养基中传代培养。考虑到重复群落是在相同栖息地构建的，并从同一物种库中接种，因此，在重复群落组成中任何观测到的变化都表明来自区域物种库的随机定殖，以及在物种水平上产生可替代性的群落结构。对于大多数的初始微生物组，其重复群落在物种水平上构建了可替代的稳定组成，而在科水平上的群落结构仍发生了汇聚 (图1E)。对于剩下的初始微生物组，所有重复样品均表现出非常相似的种群动态，并在所有的分类水平上演变至相似的种群结构。重复群落之间种群动态的再现性表明，实验误差并不是群落组成差异的主要来源。在新鲜培养基中进行连续稀释所导致的种群瓶颈对观测到的种群动态变化影响不大。然而，稀释因子可以通过引入种群瓶颈之外的方式影响群落的构建，例如，通过设定稀释之间的传代数，和通过在之前的生长阶段在一定程度上进行稀释。

尽管在物种水平上观测到群落结构的变化，科水平吸引子 (attactors) 的存在表明基本规则支配着群落的构建。最近关于自然群落的研究一致发现，在类似栖息地中环境过滤的选择作用会使功能趋同，同时允许每个功能类群内部存在分类变异。众所周知，肠杆菌科的磷酸转移酶系统和假单胞菌科的腺苷三磷酸结合转运蛋白使这类微生物具有葡萄糖摄取能力，由于这种竞争优势，肠杆菌科和假单胞菌科在葡萄糖培养基构建的群落中可能出现固定的比例。这就表明，如果在合成培养基中添加不同碳源，观测到的科水平吸引子可能会发生变化。对于剩下的接种液，所有重复样品均表现出非常相似的种群动态，并在所有的分类水平上平衡至相似的种群结构。重复群落之间种群动态的再现性表明，实验误差并不是群落组成差异的主要来源。在新鲜培养基中进行连续稀释所导致的种群瓶颈对观测到的种群动态变化影响不大。然而，稀释因子可以通过引入种群瓶颈之外的方式影响群落的组装，例如，通过设定稀释之间的传代数，和通过在之前的生长阶段在一定程度上进行稀释。

尽管在物种水平上观测到群落结构的变化，科水平吸引子的存在表明基本规则支配着群落的组装。最近关于自然群落的研究一致发现，在类似栖息地中环境过滤的选择作用会使功能趋同，同时允许每个功能类群内部存在分类变异。众所周知，肠杆菌科的磷酸转移酶系统和假单胞菌科的腺苷三磷酸结合转运蛋白使这类微生物具有葡萄糖摄取能力，由于这种竞争优势，肠杆菌科和假单胞菌科在葡萄糖培养基组装的群落中可能出现固定的比例。这就表明，如果我们在合成培养基中添加不同碳源，观测到的科水平吸引子可能会发生变化。

为了确定外部提供的碳源对环境过滤的影响，采用柠檬酸盐或亮氨酸中的一个碳源来代替葡萄糖，重复了先前的群落构建实验。与葡萄糖培养基中的情况一样，柠檬酸盐或亮氨酸培养基中在构建的重复群落，在ESV水平的组成存在很大差异，但在科分类水平上的吸引子会聚集于特定碳源 (图2A)。通常，在科分类水平上，相同碳源中传代群落之间的相似度要高于相同环境样品的传代群落相似度。柠檬酸盐培养基中稳定的群落组成中，肠杆菌科的比例显著低于其在葡萄糖培养基中的比例，反而富集了更多的黄杆菌科；相对与葡萄糖和柠檬酸盐培养基的群落，在亮氨酸培养基上稳定的群落，肠杆菌科没有增长，而富集了更多的丛毛单胞菌科。这些结果表明，所提供的碳源调控了群落的构建过程。此外，本文采用了机器学习方法量化这种影响，并训练支持向量机来从科水平群落组成预测所提供碳源的一致性，最终获得了97.3%的交叉验证精度 (图2B)。重要的是，本研究发现当考虑了科水平分布的尾端 (而不仅仅是两个主要的分类群) 会增加预测的准确性 (图2B)，这表明群落构建中由碳源介导的决定性可以延伸到整个科水平分布，包括稀有组分。

本研究中的特定环境不是选择最合适的单一物种，而是选择能够共存且比例固定的多菌科复杂群落，这些菌科能够通过碳源进行有效预测。我们假设，分类学上的聚集可能反映在科水平上保守的功能选择性。与此观点一致的是，本文发现每种类型碳源中构建的群落宏基因组表现出了大量的聚类 (图2C)，并且在代谢通路中富集。当在琼脂板上涂布稳定群落，通常会在每个平板中发现多个可识别的菌落形态，表明每个群落内的多个分类群能够外加单一碳源的条件下独立生长。这表明，使每个群落中能够代谢单一外加碳源的基因和途径分布在群落的多个分类群中，而不是仅存于最佳竞争物种中。

图二

科分类水平以及宏基因组吸引子与不同碳源相关联。(A和B) 分别以葡萄糖、柠檬酸以及亮氨酸作为限制碳源的条件下，全部样品在科分类水平的群落组成。(A) 根据不同碳源标记颜色。(B) 根据起始接种样品标记颜色。(C) 利用一个支持向量机制从科水平群落接种进行碳源分类。通过10次交叉验证过滤掉低丰度类群。仅包含肠杆菌科和假单胞菌科模型得到的分类精度~93%，而保留低丰度类群时，分类精度可达到~97%。(D) 通过PICRUSt和随机邻居嵌入 (tSNE) 推断宏基因组，表明碳源与每个群落预测功能的能力密切相关。

结果 3

这种趋简性是种间竞争和代谢副产物带来的普遍性互养共同作用的结果，后者促进了不同物种的共存。

经典的消费者-资源模型 (consumer-resource model) 表明，当多个物种竞争单一的、限制增长的外加资源时，竞争排除是唯一可能的结果，除非其他特定情况。尽管这些微生物在实验室和自然界中改造自己生存环境的能力已经得到了很好的证明，这种情况并不能充分反映微生物的情况。因此，本文假设在实验中观测到的竞争物种的共存可能是由于微生物向环境中分泌代谢副产物，然后被其他群落成员利用的一般趋势。

为了确定由代谢副产物介导生境形成的合理性，对一个代表性的葡萄糖群落进行了更深入的分析。本文分离了这个群落中丰度最高的四种菌属 (假单胞菌属、拉乌尔菌属、柠檬酸菌属以及肠杆菌属)，共占该群落微生物总数的97% (图 3A)。这些的分离菌株具有不同的菌落形态以及表型，所有个体都能以葡萄糖作为唯一碳源，这表明每一个分离菌株都可以竞争提供的单一资源。当将这四种分离的菌株混合在一起时，群落进行自下而上的重组，这四个菌株都能够稳定地共存。为了测试这个群落交叉互养的可能性，将这四个分离菌株在含葡萄糖为唯一碳源的培养基上单一培养 (图3B)。在生长周期结束时，葡萄糖浓度过低，无法检测，这表明所提供的碳源都被消耗掉了，而培养基中任何碳源都来自于前一批微生物细胞分泌的代谢副产品。为了检测这些分泌物是否足以支持该群落中其他物种的生长，将剩余的培养液进行过滤移除细胞，并添加到新鲜的培养基中作为唯一碳源 (图3B)。结果发现所有的分离菌株都能够在其他菌株的分泌物上生长 (图3C)，形成完全连接的易化网络 (facilitation network) (图3D)。分离菌株能够在其他群落成员的分泌物中快速生长，通常包括多次二元变换 (diauxic shifts)，而且在分泌物中的生长量与其在葡萄糖培养基的生长量相当，这表明在这个代表性群落中，分泌的副产物是丰富多样的。

为了确定依赖代谢副产物的生长是否普遍存在，本研究利用另外95个葡萄糖培养的稳定群落，在以葡萄糖作为外加碳源进行另外48h的生长。在所有的95个群落中，葡萄糖在生长24h后完全耗尽，但大多数群落在葡萄糖耗尽后仍继续生长 (图3E)。此外，在分泌的副产物中，群落能够大量生长：平均而言，群落依赖分泌物增长的生物量相当于其依赖葡萄糖产生的生物量的25% (图3F)。而体系中渗透性或明显裂解的细胞数量很少。虽然不能完全排除细胞死亡对结果的影响，仍验证了一种假设，即代谢副产物 (而不是细胞裂解) 是观测到的交叉互养的主要来源。

最近的研究表明，通过细菌代谢改变pH也可能具有重要的生长限制作用，并可能成为微生物群落构建的驱动因素。本研究表明，虽然单个分离菌株在葡萄糖作为单一碳源生长时可以大幅酸化环境，但是在葡萄糖培养基中生长的稳定群落对pH变化不大，大多数群落降低不超过1个单位，并且在生长48h后所有群落pH均稳定在6.5。在其他碳源中，如亮氨酸，pH甚至比葡萄糖更稳定。总而言之，本研究结果表明，相对于单一培养中观测到的效果，群落可以“缓冲”发酵酸化作用。虽然超过了本研究的范围，但是阐明其他可能发生稳定竞争的机制的作用，如噬菌体捕食或非传递竞争网络，将更充分地描述这些微生态系统中相互作用的格局。

图三

非特异性代谢简易化可稳定对所供应资源的竞争。(A) 在葡萄糖培养基中分离代表群落中丰度最高的四个菌属。(B) 实验方案：将分离株在补充有0.2%葡萄糖的1 × M9培养基中独立生长48h，之后从悬浮液中滤出细胞。在不存在任何其他碳源的情况下，将滤液与2 × M9培养基1:1混合，并用作所有其他分离株的生长培养基。(C) 分离的柠檬酸杆菌在M9培养基 (灰色)，以及在M9-肠杆菌单一培养后的滤液培养基上的生长曲线 (黑色)。(D) 所有分离株在其他每个分离株的代谢副产物上生长，并通过逻辑模型拟合生长曲线。(E和F) 通过检测不同孵育时间的OD620，获得M9葡萄糖培养基中的95个稳定群落的生长曲线 (灰色）。

结果 4

在竞争模型中加入代谢副产物互养的因素之后，可以预测群落构建的结果。

实验结果表明，单一限制营养素的竞争可以通过非特异性代谢促进其稳定共存。为了测试这个特征是否能够促进共存，本文通过经典的MacArthur消费者-资源模型模拟了单个外加碳源的群落构建过程，该模型还包括非特异性交叉互养。交叉互养是通过一种化学计量矩阵来建模的，该矩阵编码了被消耗的资源作为代谢副产物分泌回环境的比例 (图4A)。在该模型中，所有共存的“物种”都能够在单一供应资源和其他物种的分泌物种生长。

实验表明，科分类水平的群落组成受到限制性营养素性质的影响强烈，可能取决于每个菌科的相关代谢能力。通过数学建模的模拟群落构建过程，发现尽管在物种水平上显示出差异 (图4B)，但在科水平上聚集到类似结构 (图4C)。通过计算每个模拟群落范围的代谢能力，确定了科水平趋同性与功能趋同性的对应关系，从而预测每个资源中群落范围的资源吸收率。在同一种资源上生长的群落，也有类似的摄取能力，增强了消耗限制性营养素的能力 (图4D)。重要的是，即使来自均匀分布的消费者，也没有强制性的科水平消费结构，这表明在群落层面上，功能结构的出现是消费资源模型的一个普遍特征。本文中消费者-资源模型表明菌群通过密集的易化网络稳定下来 (图4F)，与前期代谢易化网络的观测结果一致 (图3D)。因此，本文利用随机生成的代谢和资源吸收能力对群落动态进行模拟，获取了大量的定性观测结果，并概括了以前在自然群落的经验观测值。

图四

经典生态模型的简单扩展概括了实验观察。MacArthur的消费者-资源模型扩展到包含10中副产品分泌物以及单一限制营养素的消耗，由分泌系数Dβα控制。该系数编码了被消耗的资源α转化为资源β作为分泌回环境的比例。(A) 使用随机取样分泌和摄取速率模拟导致多个竞争者共存，而将分泌速率设定为零消除了共存 (插图) 。(B和C) 尽管“物种”水平结构存在变化 (B)，随机生态系统通常会像“科”水平结构相似的方向收敛 (C)。(D) 计算了群落的全部资源吸收能力，并且与科水平结构一样，与所提供的资源高度相关。(E) 群落不仅由科水平的单个代表简单组成，而且通常有科水平的几个物种组成，与我们实验观测到的类似。(F) 通量分布的拓扑结构表明，幸存的物种都在竞争主要营养物质，并且通过分泌副产物的特异性消耗来稳定竞争。

讨论

1

在没有微生物构建理论的情况下，通常很难确定自然微生物组的经验观测特征是否是系统特定决定因素的结果。研究结果表明，大型消费者-资源生态系统的一般特征包括：即使在简单环境中也存在着巨大的分类多样性，功能稳定的群落仍存在着物种更替，以及对营养素如何决定群落组成 (不同分类深度上) 的可预测性和变异性。这些特征不仅在本实验中被观测到，在人类肠道、植物叶片以及海洋等多种系统中被报道。因此，本研究结果为这些经验结果的普遍性提供了解释，并表明它们可能反映了大型自构建微生物群落的普遍性和通用性。然而，这些模型缺乏生物化学细节，因此无法解释其他实验结果。

2

上述理论和简单的实验设置研究了稳定群落构建的广泛机制。有证据表明，密集连接的交叉互养网络可能会促进这些高度相关物种的稳定竞争，这些物种都是供应碳源的有力竞争者。这种交叉互养网络导致总体而非成对的相互作用，支持了高阶互养作用在复杂微生物群落的稳定中起着至关重要的作用的假设。这些结论是否在具有大量外部供应资源且更复杂的环境中通用，仍有待阐明。本研究提出，采用高通量自上而下 (top-down) 的方法对群落构建进行直接的数学建模，这是一种未被充分利用但非常有前景的途径，可用于确定微生物组构建的通用机制和统计规则，同时也为开发微生物组的定量理论提供了一个敲门砖。

参考文献：

Goldford, J. E., Lu, N., Bajić, D., Estrela, S., Tikhonov, M., Sanchez-Gorostiaga, A., Segrè, D., Mehta, P., Sanchez, A. (2018). Emergent simplicity in microbial community assembly. Science. 361(6401): 469-474. DOI: 10.1126/science.aat1168.

原文链接（点击阅读原文）：

http://science.sciencemag.org/content/361/6401/469.full 

中国科学院生态环境研究中心

环境生物技术重点实验室

邓晔 研究员课题组发布

作者：张照婧

编辑：吴悦妮

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