PBio-2018：如何设计可预测植物表型的微生物组
The following article is from 植物微生物组 Author 胖哒姑凉
本文是由Jeffery L.Dangl团队今年2月份发表于Plos Biology期刊上的一篇研究性论文。
摘要：
复杂微生物组中的特定成员是否可以影响宿主表型，这取决于非生物环境和其他微生物的存在。因此，确定可以预测宿主表型的细菌组合是具有挑战性的。
我们发现，通过植物-细菌二元关联分析可以设计合成可以预测宿主表型的小型菌群。
具体而言，我们以可预测的方式构建的合成群落，可以改变茎中的磷酸盐积累，并诱导磷酸盐饥饿响应基因
我们发现，植物的细菌定殖并不是我们分析植物表型所用的预测因子
最后，我们证明，描述所有可能的细菌人工合成群体中的一部分，足以预测未经测试的细菌群体的效果。
我们的研究结果表明，推测微生物组成员和宿主表型之间的因果关系是可以实现的，利用这些推论可以合理的设计新型菌群。
微生物组影响宿主生长发育和健康，但是如何对这些微生物组产生的植物表型进行预测目前还是一个挑战。
前期关于这方面的研究有两个，一个是以斑马鱼为材料对其共生微生物进行少量组合，预测其对宿主免疫的影响；另一个是将小鼠肠道微生物随机组合。这两个研究共同的一个局限性，是他们都将组合后的群落看成一个整体，很少研究每个部分的贡献，
所以本文在提出如何预测植物表型这个科学问题的基础上，从单个菌株功能出发，再进行组合，最后达到预测宿主表型的目的。
具体来说，本文选择的是和磷营养相关的植物表型，在缺磷条件下，植物产生磷酸盐饥饿响应PSR，正文中Pi表示磷酸盐、Phi表示亚磷酸盐。
这个图是作者设计实验的整体思路：
首先是通过体外筛选、与植物的二元关联实验来对细菌本身的性质、功能做一个描述。第二步是根据细菌对植物茎磷酸盐含量的影响将其分为几个小组，第三步再将这些小组两两组合，合成菌群，第四步是研究这些合成菌群对植物生理指标、转录组等方面的影响，然后基于这些数据通过神经网络分析预测新的菌群对植物的影响，最后再对预测的结果进行验证。
以下是本实验的主要研究结果：
首先是体外筛选，第一张图描述的是如何得到植物根系分泌物，在培养基中加入不同量的磷酸盐，分别使用高磷和低磷两种处理，植物生长一段时间后，转移到相反条件的液体培养基中继续培养，然后得到根系分泌物，并且检验分泌物中代谢物的含量。下面的这个热图就是说明，Pi变化足以诱导植物分泌物中的初级代谢产物发生变化。
根系分泌物的变化对细菌也会产生影响，右上图展示的是，作者将不同处理下所得的根系分泌物加到细菌培养板中，细菌培养板是440种从十字花科植物根系分离所得的细菌，每隔一段时间测OD值。
从下面两个图中可以看出，根系分泌物可以增强或抑制细菌生长，而且这个效应是广谱性的。最后根据细菌在不同Pi条件下的表现，将这400多种细菌分为10组，并且选择了其中的183种细菌进行下一步试验
左边这个图是二元关联实验的实验设计，
首先在种子发芽阶段设置了高磷和低磷两个浓度（1mM，5μM），然后6天后将幼苗移栽到新的平板上，再分为高磷和低磷两个浓度（30μM和100μM）。
然后将前期筛选所得的183个细菌，分别接种到平板上，观察在不同磷浓度梯度条件下，菌株对植物茎Pi含量的影响。
从右图上可以看到，细菌接种后，茎Pi含量普遍有所降低。而且在低磷条件下，这种负面效应最显著。
左边的热图显示的是，与无菌幼苗相比，接种单个菌株的植物之间茎中Pi含量的log（倍数变化）对数值。
可以得出相似的结论，就是在环境中Pi含量较低的时候，菌群和植物对有限的磷酸盐产生竞争关系，菌株对磷含量的负面效应更加明显；在Pi含量较高的时候，这些细菌则也会帮助植物吸收Pi。所以说细菌对植物茎Pi含量的影响是收到植物本身营养状态调节的。
作者也研究了磷饥饿反应的激活和植物-微生物互作模式之间的关系：
在植物发芽期间，在在培养基上分别使用：不添加磷、添加亚磷酸盐、添加磷酸盐三个处理，不添加磷的处理可以激活PSR，添加亚磷酸盐和添加磷酸盐均不能激活PSR反应，但是亚磷酸盐处理也是一种低磷状态。
在左图中，不同的颜色代表六种单菌处理，纵轴是这些细菌的侵染量，可以看出每个处理组三种磷状态下的侵染量差异不大，说明PSR是否激活对细菌的定殖没有影响。然后右边的这个表显示的是，和无菌苗相比，不同菌株在不同处理下对植物茎Pi含量的影响，蓝色的代表产生抑制作用的菌株，红色的是促进作用的，所以可以看出，在细菌侵染量没有显著差异的条件下，细菌与植物互作的结果发生了改变，所以说明PSR反应激活会改变细菌对植物Pi含量的影响
从上面单菌功能的验证试验中选择78个菌株，根据他们对植物Pi含量的影响分成正效应、负效应和无显著影响三类，分别是P、N、I，每个大类又进一步分成三个小组，所以一共将这些菌株分为9个blocks。
右图是分组示意图，将9个模块两两组合作为一个人工合成群体，其中9种群体是直接将相邻小组进行组合，内圈的5种是将正效应的P组和其他N、I小组进行组合。
两个图分别显示的是人工合成群体和单一小组接种后对植物相关生理指标的影响。可以得到两个结论：
1.在低磷条件下，大多数合成群体也会降低植物茎Pi含量，尤其是在Negative blocks中。与此同时，植物也表现出主根缩短、茎面积减少、根系网络扩大等表型。
2.在高磷条件下，大多数合成群体未显著降低Pi含量。
这个图解释的是这些细菌blocks组合起来对植物表型的影响。
X轴表示的是，和无菌苗相比，合成菌群导致的植物表型变化，取值也是log倍数变化；Y轴表示的是通过构建模型计算所得的预期结果。每个点代表14个合成菌群，然后实际值和期望值之间的相关性用回归线表示。
所以，预测的和测量的表型改变之间的一致性，证明了功能是可叠加的（Additivity）
证明功能可叠加之后，作者想知道，细菌的丰度和植物表型有没有相关性：
左边的图分成两个部分，上面是理论输入值，就是从理论上讲，合成菌落的物种组成；下面是四种磷条件下实际的相对丰度，可以看到无论是在琼脂中还是在根系样品中，和理论值都有一定的差异，所以细菌和细菌之间的相互作用对最终群落的影响很大。
右图是将参考量化相对丰度的数据加入到叠加模型中。令人惊讶的是，所有情况下（16/16）当合并相对丰度的时候，由微生物群落影响的植物表型变异都下降了。所以结果表明，忽略相对丰度的模型可以更精确的预测。
作者通过RNA-Seq，研究了不同条件下，不同合成群体接种后对植物PSR相关基因表达量的影响：
下面作者研究了整个植物全基因组在不同Pi条件下，对菌群的转录相应：
从左边的热图中得出结论：
Positive blocks：参与产能相关基因的表达量较高；
Negetive blocks：诱导与非生物胁迫响应相关的基因表达，尤其是和脱落酸相关的基因
BC 图中可以看到N blocks对涉及到硫代葡萄糖苷生物合成和JA响应的基因表达有促进作用。
当环境Pi含量较低(30 μM Pi)时，观察到正负效应模块之间有更多的差异表达的基因，负效应模块对磷酸盐饥饿和防御反应相关基因的表达量更高。
D图是低磷条件下，前面的研究结果表明含有Negative blocks的合成群体会表现出较强的PSR信号，所以这里集中展示了分别含有N1和N3的合成菌群103个基因的表达量，这些基因主要是和胁迫有关的基因。其中N3是负效应最强的一个block，可以看到N1和N3的表达量是较大的差异
E：降解Pi转运蛋白的PHO2（泛素相关E2酶）F：生长素调节基因ARGOS。作者举着两个例子证明，植物相关抗性基因表达受特定的菌群组合（如图中N2N3等）所诱导。
基于已有数据，作者通过建模来得到预测菌群表型的目的：
A：用于预测的神经网络示意图。节点是神经元，箭头是根据数据计算所得的权重。
B：来自三种模型的交叉验证误差，这些模型测试的事预测茎Pi含量的能力，每个模型都经过除某个之外的所有合成菌群进行训练，然后评估该合成菌群。每个点代表平均Pi含量的预测误差。
NN具有三个模型中最低的交叉验证预测误差，且差异性十分明显（p=0.0073）
神经网络能捕捉简单模型所不能捕捉到的信息（如线性）
C：对于每个类型的模型，每个生物学变量对Pi积累的敏感性。每个点代表在某种特定的组成下，茎Pi含量的改变
D：通过神经网络预测的结果，选择25个对茎Pi浓度显著促进作用的组合进行替换，两两组合获得新的人工合成群落
E：然后在将合成群落做功能验证，实验观察值和NN预测值进行比较，深蓝色是显著相关的点，绿色是不相关
F：是比较三种模型的预测误差，可以看到NN的预测标准误差最低。
结论：
回顾一下全文，作者从一个确定的细菌集合中，基于单个菌株/blocks的功能，合理地来自定义可能的可行的组合，提供了研究各种宿主-微生物组系统的一般方法。最终证明，通过深度学习技术，可以找到宿主表型、微生物群和非生物环境之间的复杂关系。通过测试多个合成菌群中的每个细菌模块，可以成功验证来自神经网络分析的预测，证明了在这个复杂的系统中预测植物表型，可以推断因果关系并获得一般性结论。
这个方法有助于合理的设计和组合微生物，来提高改善宿主对生物和营养胁迫的反应
猜你喜欢
10000+：菌群分析 宝宝与猫狗 梅毒狂想曲 提DNA发Nature Cell专刊 肠道指挥大脑
文献阅读 热心肠 SemanticScholar Geenmedical
16S功能预测 PICRUSt FAPROTAX Bugbase Tax4Fun
生物科普: 肠道细菌 人体上的生命 生命大跃进 细胞暗战 人体奥秘
写在后面
为鼓励读者交流、快速解决科研困难，我们建立了“宏基因组”专业讨论群，目前己有国内外2200+ 一线科研人员加入。参与讨论，获得专业解答，欢迎分享此文至朋友圈，并扫码加主编好友带你入群，务必备注“姓名-单位-研究方向-职称/年级”。技术问题寻求帮助，首先阅读《如何优雅的提问》学习解决问题思路，仍末解决群内讨论，问题不私聊，帮助同行。
学习16S扩增子、宏基因组科研思路和分析实战，关注“宏基因组”