PNAS：人工构建玉米极简微生物组
本文是牛犇老师（现任东北林大教授）2017年在PNAS上发表的关于玉米微生物组的文章，其研究思路以及方法都很值得大家参考和学习！现将本文内容概要分享给大家，如有不准确之处望大家指正。
链接: http://www.pnas.org/content/114/12/E2450
PDF: http://www.pnas.org/content/pnas/114/12/E2450.full.pdf
摘要
植物相关微生物对于宿主生长和健康有十分重要的作用。前期的研究发现，宿主的基因型以及非生物因素都会影响植物相关微生物组，但是通过实验研究这些微生物群落具有很大的困难，所以本文通过玉米宿主富集作用，作者得到了一个由7种细菌 Enterobacter cloacae, Stenotrophomonas maltophilia, Ochrobactrum pituitosum, Herbaspirillum frisingense, Pseudomonas putida, Curtobacterium pusillum 以及Chryseobacterium indologenes组成的极简微生物组。通过选择培养的方法跟踪每种菌的丰度，作者发现只有当 Enterobacter cloacae 菌株被移除时群落会完全解体，并且由Curtobacterium pusillum接管。这个结果表明E. cloacae在这个模型生态系统中发挥着keystone species的作用。
在体外以及植物实验中，作者发现人工重组微生物群落明显抑制真菌病原Fusarium verticillioides的定殖，对宿主有明显益处。因此，代表根际微生物组的人工合成微生物群落可以为研究细菌间相互作用影响根际微生物组成以及根际微生物对宿主的有益作用打下基础。许多研究已经已经建立起了简化微生物群落与宿主作用的模型。比如模式植物拟南芥的简化的38个细菌人工菌群揭示了拟南芥基因通过调节免疫系统来影响根际微生物组成。细菌在拟南芥根系和叶子的定殖对拟南芥根和叶的定殖分离的的数以百种细菌表明,这些微生物群在它们的同源植物上组成很相似。
本文重点：定殖于植物的微生物是由多个物种组成的复杂群落。复杂的群落组成使研究微生物组与植物的互作十分困难。在本文的工作中，作者人工重建了一个极简，具有代表性的合成细菌群落。从而可以研究在无菌玉米种子上的群落组成的动态过程以及功能。本群落可以抑制植物病原真菌的生长，从而保护植物，这个模式系统可以为今后研究植物与微生物互作提供基础。
背景
作者从前人的研究寻找与植物相关的物种组成，发现植物的根系对微生物有着显著地选择作用，使其微生物显著区别于根围和非根际微生物，这些结论已经在小麦，番茄，黄瓜，水稻，大麦，甘蔗，棉花上用高通量进行鉴定的方法进行过验证。一个简单的宿主微生物群落系统可以用无菌宿主接种特定的微生物群落来确定。许多研究已经已经建立起了简化微生物群落与宿主作用的模型。[Lebeis SL, et al. (2015); Bai Y, et al. (2015); Bodenhausen, N., (2014)]。比如模式植物拟南芥的简化的38个细菌人工菌群揭示了几个拟南芥基因通过调节免疫系统来影响根际微生物组成。细菌在拟南芥根系和叶子的定殖对拟南芥根和叶的定殖分离的的数以百种细菌表明, 这些微生物群在它们的同源植物上组成很相似。
宿主富集实验设计：作者使用表面消毒的种子，使其发芽然后将幼苗在土壤中种植一个星期左右，然后将根系在PBS中捣碎。
实验策略一：
用根组织悬浮液接种表面消毒的种子，然后将其放置在无菌1/2 MS培养基中生长。用超声方法将细菌从根系部分洗脱下来，然后在0.1× TSA培养基上进行培养。作者测了61个菌株作者选取了Ochrobactrum 和 Herbaspirillum属的菌从中各选取了一个种O. pituitosum and H. frisingense. 作者选取了Enterobacter属的细菌E. cloacae 和 Enterobacter asburiae是因为在前人报道中这两种菌是甜玉米的根系内生菌 。然后作者将12株菌按每个菌10的8次方浓度等量混合，然后接种到10株幼苗上。
实验策略二：
作者直接将根系悬液涂布到0.1×TSA培养基上以获得单克隆菌株，作者共选取了33株菌。这33株菌加上策略1拿到的两株菌以及前人研究透彻的 3株菌rhizobacterial strains，Bacillus amyloliquefaciens , Paenibacillus polymyxa和 Azospirillum brasilense，一共38株菌用于最后人工菌群构建实验，作者将38株菌按每个菌10的8次方浓度等量混合，然后接种到6株幼苗上。经过5天生长后，作者用扩增子测序的方法来研究菌群的变化。Enterobacter占据主导地位，Raoultella ornithinolytica 和 Dyella sp. 几乎不可检测到，作者发现尽管策略二的菌株多很多，但是最后微生物群落的结构却很类似。作者确定了7种菌的人工菌群组合，然后用这7种菌等量接种幼苗，经过15天生长后，作者发现这7种菌都还稳定存在。 并且重要的是，在不同植株之间的差别还特别小！显然，这七个菌群绝不是唯一的组合可能。实际上，作者也测试了这7个属中的很多其它的种，作者把这7个菌加上其它种的菌一起测试，但也得到了和前面很类似的结果。有趣的是这7个菌在玉米根系本来就属于高丰度菌。作者也通过OTUs分析了原本的菌群组成，并找到了这7株菌的代表性序列。
方法与结果
1.土壤，根际土，根部的微生物组成
目的是了解哪些菌在群落组成中含量较高从而结合后续宿主富集选择菌株组成人工群落样品处理方法按照参考文献对拟南芥的处理。MIseq测序；QIIME分析OTU；土中玉米根部细菌分离：稀释涂平板，单菌落纯化分离。细菌鉴定：细菌97度5min，-80度冷冻15min裂解后进行PCR反应，用于PCR的DNA样品浓度为20 ng/μL，引物为F515 (5′GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′) and R806(5′GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)
图1：微生物类群丰度的柱形图。A,B代表不同土壤样品。
2.宿主主导的微生物群落选择
选择在土中长7天的玉米人工收集，土通过抖落根获得，根用手术刀在植物上切除，放入含有30ml PBS和3mm玻璃珠的50ml离心管中，涡旋15min，根放入含有20ml PBS和无菌石英的无菌研钵中，用无菌的杵碾碎。无菌种子在含有根的悬浮液中浸泡1h。种子放在1/2 MS 培养基中ph=6，无外来污染种子在B中的双层管中生长：接种了菌的种子放在含有20 mL 1/2 MS agar的玻璃管内生长，另一个玻璃管用来封口，中间用保鲜膜阻隔。
不同的玻璃管放在相同的培养箱中生长，生长7天后，用PBS简单冲洗根部后收集5个1cm根碎片（去除侧根）。根碎片放在1.5ml管中，每个管中放6个3mm玻璃珠，和1mlPBS。小管子超声30s涡旋1min，重复两次，然后细菌将存在于菌悬液中。100微升菌悬液接种在0.1× TSA平板中。平板在30℃放7天，然后将不同形态的菌落纯化。纯化的菌落保存在甘油中。用16Sr DNA鉴定细菌，选择一些进行第二次的宿主选择。然后对选择出来的菌制成悬液，无菌种子在这次的菌悬液中浸泡然后在1/2 MS agar中生长。5d后选择10个种子，用16S rDNA基因序列鉴定根部群落组成。
方案2：
第一次的菌悬液中每个种选择一个菌株，然后制成菌悬液浸泡无菌种子，培养在1/2 MS agar中，5d后选择6个种子进行16S rDNA基因序列鉴定根部群落组成。两次方案的菌群接种在种子上15d后鉴定动态过程，考察群落稳定性确定最终的群落组成。
A.图注：简化微生物群落通过宿主富集实现,本文使用了两种策略。1，A. calcoaceticus 和 P. poly- myxa 通过第二种策略可以得到，却没有通过第一种策略得到。两种策略都是基于16S rRNA基因测序和CFF进行序列分析。Chryseobacterium rhizosphaerae, A. calcoaceticus, and P. polymyxa 只在策略二中使用在图中标为粉色。
B图注：含有7株细菌的人工合成群落在玉米根部的动态过程。检测基于接种0-15天的16S rRNA测序。纵坐标表示每种菌的相对丰度，用16S rRNA序列的百分含量表示。
3.重组群落稳定性验证及群落动态过程测量
接种之前取出4ml菌悬液进行cfu计数和16s测序。然后用菌悬液接种无菌种子，无菌种子在B装置中生长，以及不接种的种子作为对照，15d后，取3个种子，通过16S rRNA和cfu counting的方法测量群落组成。以7株菌组成的群落，以及移除任意1株形成的6株菌形成的群落为对象，接种在无菌种子上，生长在B装置内，以无菌种子作为对照，生长5，10，15d后，取3-5个样品，以及3个接种之前的根样品，按照紫色字部分进行处理得到菌悬液，菌悬液涂在TSA平板上，记录cfu，计算移除1株后的群落之间的组成差异。
图注：15天内7种细菌组成的人工群落以及移除任意一种细菌后剩余6种细菌组成的人工合成群落的物种组成的聚类分类。−Sma, −Opi, −Cpu, −Ecl, −Cin, −Hfr, and −Ppu 分别代表移除下列细菌 S. maltophilia, O. pituitosum, C. pusillum, E. cloacae, C. indologenes, H. frisingense, and P. putida, 的6种株细菌组成的人工群落。
4.无菌苗制备的方法
种子表面消毒和催芽：1.首先在70%酒精中浸泡3min； 然后在5% 的次氯酸钠中浸泡3min；然后在无菌水中洗3次，用灭菌的滤纸吸干表面水分。取250 ul最后一次洗涤的无菌水涂布到TSA 培养皿上, 在30度下培养检查染菌情况。 然后将每15个种子置于加有7ml无菌水的9cm培养皿在30℃下黑暗培养（50-55h），间隔24小时进行换水并且检查水的染菌情况。
5.幼苗的真菌和细菌的接种实验
用于接种的细菌首先在 0.1 × TSA 平板上划线培养 24–48 h、30 ℃)，然后挑取单克隆置于含5 mL 的 TSB的培养基中，30 °C 下摇床过夜培养。然后将50微升的培养物转移到一个新的5-mL TSB培养液中在30 °C 下摇床培养8 h. 通过离心收集微生物，然后在1× PBS buffer 中重悬。 最后将每一种微生物浓度调节到108 个/ml，然后将所有微生物在 50-mL 无菌离心管中等量混匀。人工菌群接种方法然后将根长1-2cm表面消毒的玉米幼苗在混合菌液中浸泡0.5-1小时。在植物促生实验中, 细菌的浓度被调节到 106 cfu/cm2 （紫外分光光度计进行调节）然后在含有水琼脂的塑料平板上生长。然后用无菌的镊子将幼苗置于水琼脂表面。在真菌生长抑制实验中， 0.5cm直径的 Fusarium verticillioides PDA 块放置在平板正中间，28 °C 下培养 7d 直到菌丝长满平板. 用八层无菌纱布收集新鲜的孢子，用血球计数板将孢子浓度控制在10的8次方/ml，最后将孢子混匀在塑料平板上的20 mL 水琼脂中。
6.基于培养方法的群落定量方法
该方法最大的挑战是怎么将这7种菌彼此区分开来。
最初作者使用了表型微阵列技术(PM)。作者用7株菌的每种都评价了288种与化学敏感性和渗透反应的相关的培养条件。最后确定了七种可以和每株菌对应的，只允许一种菌生长的条件。对于每种菌，在选择性条件下的恢复率都接近于1. 菌悬液的组成以及玉米根部群落通过群落形成单位（cfu）和16S rRNA估值。两种方法得到了相似的相对丰度，通过两种方法得到的菌悬液的组成与期望值相似，由cfu确定的组成于期望值明显正相关 (r = 0.8818, P = 0.0091). 通过两种方式得到的在玉米根部的群落组成也相似。通过16s rRNA基因测序和rRNA操纵子与通过cfu计数得到的群落结构也明显正相关(r = 0.9643, P = 0.0014)。说明cfu方法可以用来确定组成。 尽管高通量测序在鉴定物种及丰度上很有用，但它也有很多局限性：1. 周期长；2. 它们并不特别适合于准确地确定群落中每个物种的绝对丰度；3.宿主DNA的干扰以及PCR扩增的错误。
方法二：100微升菌悬液包括每种菌和 BiOLOG染料放在每种板中，每个板都有培养基和染料的负对照。放30度48h，如果表型在孔中成正相关，会形成紫色，如果负相关，紫色会变浅。OD 590 减 OD 750用来定量颜色，选择出可以筛选每种菌的化学物质组成。10 μL (108 cells per milliliter in PBS)包括每种菌的菌悬液涂在 0.1 × TSA 平板上，配制含有不同化学物质的培养基，然后对每种培养基上的cfu人工计数，计算回收率，通过cfu计算和扩增子测序比较相对丰度，证明cfu计算的可行性。
图注：比较分别移除掉不同的1中微生物之后，在第5天，10天及15天中，剩余6个物种的群落以及7个物种的群落的欧式距离变化关系。−Sma, −Opi, −Cpu, −Ecl, −Cin, −Hfr, and −Ppu 分别代表移除下列细菌 S. maltophilia, O. pituitosum, C. pusillum, E. cloacae, C. indologenes, H. frisingense, and P. putida, 的6种株细菌组成的人工群落。星号代表具有显著性。
图注：比较依赖培养菌落的方法和16s rRNA测序的方法决定人工重建群落的物种组成，两中统计方法都对细胞悬液（cell mix）和在生长15天的玉米根部定植程度（in planta）基于16s rRNA测序的计数方法得到的结果标记为Reads，基于平板上菌落计数方法的结果标记为CFUs。
作者确定了7中菌的组合然后用这7种菌等量接种幼苗，经过15天生长后，作者发现这7种菌都还稳定存在，并且重要的是，在不同植株之间的差别还特别小！显然，这七个菌群绝不是唯一的组合可能。实际上，作者也测试了这7个属种很多其它的种，作者把这7个菌加上其它种的菌一起测试，但也得到了和前面很类似的结果。 有趣的是这7个菌在玉米根系本来就属于高丰度菌。更重要的是作者还找到了这个7种菌中发挥Keystone speices 作用的菌株-E. cloacae，当把E. cloacae从这7种菌的群落中移除时，这个极简的微生物群落会完全解体，并且只剩下Curtobacterium pusillum作为高丰度菌存在！
图五图注：A图表示7中菌组合的人工合成菌群在15天生长周期的群落丰度变化；图B表示移除了菌株E. cloacae之后剩余的6种菌的群落丰度变化。
7.测量细菌群落的动态过程及抑制F. verticillioides实验
将含有40 μL 0.5%琼脂糖200-μL的枪头在菌悬液中放置1h，然后把枪头放在1/2 MS agar管中，3-5个管中放置0，5，10，15d，然后将琼脂糖放入1.5ml管中碾碎，然后在1mlPBS中涡旋重悬。菌悬液稀释在平板上生长，30 °C for 16–60 h， 记录cfu。基于RA值计算皮尔逊相关系数（PCCs），计算相异性系数等同上，并计算根部，琼脂糖上微生物群落的PCCs。 体内实验：先将种子浸泡在含有7株或6株的菌悬液中，然后将种子放在含有20 mL of water agar [2.25% (wt/vol)] spread with镰刀菌孢子 (103 cfu/cm2)的托盘中，然后托盘在暗处23度放10d，计算真菌定殖率：
图注：模式群落对轮枝镰刀菌的拮抗作用 a.人工合成群落对镰刀菌定植的延迟作用。b.人工合成群落对于镰刀菌菌丝在种子上生长的抑制作用。c.人工合成群落对玉米苗立枯病的生防作用。d.人工合成群落在PDA和NA培养基上对镰刀菌的体外实验抑制作用。Fve, 只含有 F. verticillioides; Fve+C7, 含有F. verticillioides 和人工合成模式菌落; Fve+H5α, 含有 F. verticillioides 和 E. coli DH5α.
讨论
许多研究已经证明植物根系能从土壤微生物中招募许多微生物来形成复杂的微生物组。而深入研究这些根系微生物的方法就是人工构建一个及其简化的多物种微生物群落。本研究提供了一个稳定且具有代表性的7个物种构成的玉米根系微生物组，重现了无菌玉米幼苗微生物的形成与发展。作者通过玉米对微生物的富集作用获得了一个简化的玉米微生物组。研究微生物群落的一个核心问题就是不同微生物是如果共存和组装成为一个群落的。构建的人工极简微生物组，通过配置不同微生物群落的组合，作者发现E. cloacae物种是这个极简微生物组中的Keystone species，并且当移除E. cloacae菌之后C. pusillum菌会取代其群落位置。当移除掉E. cloacae菌之后，S. maltophilia, O. pituitosum, 和 C. indologenes菌的丰度显著降低，而C. pusillum菌的丰度显著增加，说明了E. cloacae物种与S. maltophilia, O. pituitosum, 和 C. indologenes正相关，而与 C. pusillum菌负相关。这些和植物相关的微生物能帮助植物抵抗病原微生物，有益微生物通过直接或间接方式来拮抗病原菌。而且作者也发现了他们构建的极简微生物组能有效的控制Fusarium verticillioides导致的玉米苗枯病。然而这些复杂微生物组拮抗病原菌的分子机制还不是很清楚，本研究为未来解析这些其生防作用的微生物的拮抗机制提供有效的模式。
Reference:
Bai, Y., Müller, D. B., Srinivas, G., Garrido-Oter, R., Potthoff, E., Rott, M., … & Hüttel, B. (2015). Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature, 528(7582), 364.
Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., & Kolter, R. (2017). Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences, 201616148.
Bodenhausen, N., Bortfeld-Miller, M., Ackermann, M., & Vorholt, J. A. (2014). A synthetic community approach reveals plant genotypes affecting the phyllosphere microbiota. PLoS Genetics, 10(4), e1004283.
Lebeis, S. L., Paredes, S. H., Lundberg, D. S., Breakfield, N., Gehring, J., McDonald, M., … & Dangl, J. L. (2015). Salicylic acid modulates colonization of the root microbiome by specific bacterial taxa. Science, 349(6250), 860-864.
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