Microbiome：16S扩增子测序研究中定量变异和生物量影响
16S扩增子测序研究中定量变异和生物量影响
Quantification of variation and the impact of biomass in targeted 16S rRNA gene sequencing studies
Microbiome, [9.133]
原文链接: https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-018-0543-z
(吐槽一下，Microbiome的网站为什么有时还需要科学上网才能访问呢？)
第一作者：Jeffrey M Bender,Fan Li
通讯作者：Grace M Aldrovandi gracea@mac.com
主要单位：加州大学洛杉机分校，医学院
其它作者：Helty Adisetiyo,David Lee,Sara Zabih,Long Hung,Thomas A Wilkinson,Pia S Pannaraj,Rosemary C She,Jennifer Dien Bard,Nicole H Tobin
导读
起始生物量、生物和技术重复对结果的影响缺少定量评估和预测的方法；
本研究基于2年中19批测序的469个样本定量分析16S测序结果中变异程度；
技术变异(相同样品多批次测序)小于生物学变异(来自同一个体的多个样品)；
相对丰度越大的种属变异系数越小，而随着稀释倍数增加，底物量越小时变异越大，但与真实结果相比仍比较可信；
作者在Github共享了代码，方便同行使用变异预测模型。
摘要
背景：近年来测序技术和生物信息技术的发展，使大规模微生物组分析成为可能，推动了生物医药研究的快速进步。然而，技术或分析上很小的改变可能显著的改变结果，导致互相冲突的发展。在16S rRNA基因测序研究中，定量技术和生物学变异是大家想知道的，起始生物量对变异的影响是对当前研究中发现的解读和进一步研究计划的重要指导。
结果：数据汇编自469个测序样本，来自19批16S测序文库，时间跨度2.5年。根据负对照移除污染序列，244个样本有足够的序列进一步分析。实验内和实验间的细菌重组群体的变异系数是8.7-37.6%，和15.6-80.5%，一个细菌属的相对丰度相差大于1%。单个粪便实验间和内的Bray-Curtis距离为0.11和0.31，相同样本批次间的变异为0.38(Wilcoxon秩和检验，p=0.001)。连续的梯度稀释细菌人工群体，用于研究起始生物量对变异的影响。稀释越大，距离也越大，相对丰度在每毫克100个16S拷贝时变的不可信。基于此数据，我们建立了基于起始生物量和相对丰度值估计预期变异的模型。
结论：在良好对照的微生物组研究，可以足够稳定的获得很小的生物学效应，可获得临床分析中稳定的变异水平。相对丰度与变异负相关，与绝对量相比有更强的变异，表明在低生物量样本中检测细菌群体差异是可行的。此外，我们开发了工具，可以量化指定研究的生物学变异。
关键字：生物量、技术变异、生物学变异、精确度、准确度
主要结果
表1. 19个批次的测序
每个批次(Run，技术重复)中有细菌人工模块群体的正对照、重复的粪便样本，负对照，历时2.5年。所有样本采用相同的方式处理，在相同的测序仪。18批包括前瞻人工群体的稀释研究。括号中为样本在负对照过滤前的样本量。
点代表包括在本次分析中，漏字符代表样本缺少重复排除本分析，星号代表10个梯度稀释的人工群体测序。
图1. 细菌模拟群体样本随测序时间批次展示
a. 约2年的时间里科水平组成。横轴方块表示每个独立批次。只显示平均丰度大于1%的科。
b. 基于Bray-Curtis距离的PCoA群体组成，括号中为变异的解析率(百分比%)。
c. Bray-Curtis距离和类间相关系数(ICC)，按每个批次分层。样本间相关系数ICC值是均值。
d. 热图展示每批内主要物种的变异系数。灰条代表相对丰度。
图2. 样本质控过滤总结
a. 基于Bray-Curtis距离的PCoA，括号内为变异解析率。
b. 箱线图展示Bray-Curtis距离在样本内和样本间分布生物学和技术变异。来自相同个体的三个样本间距离用来展示生物学变异。同一样本在不同批次测序来检查技术变异。
图3. 底物量与引起的变异的关系
a. 真实和预测的16S拷贝数相关系数。
b. Bray-Curtis距离和类别内相关系数(intraclass correlation coefficients, ICC)与稀释倍数间关系
c. 热图展示主要菌属变异系数在不同稀释位数下的变化，灰度代表相关丰度
d. 香农多样性随稀释位数增加和减少
图4. 相对丰度和生物量与变异的模型
a. 拷贝数与变异系数相关性
b. 相对丰度与变异系数相关性
X轴采用Log10对数变换
表2. 底物量和相对丰度与变异的线性回归模型
基于16S基因拷贝数和平均相对丰度的线性回归模型和预测变异值的总结。
总结
本研究，作者从严禁对照的微生物组实验中获得了样本的变异样式，建立的基线可用于将来研究中更准确的结果解读。在良好对照条件下，样本内和样本间的变异对结果有效性影响不大。我们进一步阐明了最小的生物学变异(e.g., 来自相同供体的三个粪便样本)超过了技术变异。最后，相对丰度对变异的影响要大于底物量。基于量化的生物量和相对丰度对组成变异的效应，我们提出了工具可在将来的研究中预测变异的范围。
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