PNAS: 干旱延缓高粱根系微生物组的建成并富集革兰氏阳性菌
The following article is from 植物微生物组 Author 胖哒姑凉
Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria
Proc Natl Acad Sci U S A.
2018 May 1;115(18):E4284-E4293.
First author: Ling Xu
Correspondence author：Devin Coleman-Derr
Author Information: Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley
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干旱延缓高粱根系微生物组的建成并富集革兰氏阳性菌
重要性
干旱是达成下个世纪粮食需求量必须克服的关键障碍，而了解干旱胁迫、植物发育以及植物微生物组之间的相互作用是应对这一挑战的关键所在。
本文中，我们证明了干旱会导致植物根系富集不同的微生物组，并且几乎完全由革兰氏阳性菌组成，缺乏外膜并具有较厚的细胞壁。
我们证明了，在干旱期间，根系会产生更多的代谢物，并且富集单层细菌的干旱处理组植物根系的相同化合物中相关的转运蛋白活性有所增加。
这种由于干旱诱导的植物-微生物之间代谢物的富集和交换转换，揭示了植物微生物组可以改善植物的适应性，可通过这一途径提高作物产量。
摘要
Drought stress is a major obstacle to crop productivity, and the severity and frequency of drought are expected to increase in the coming century. Certain root-associated bacteria have been shown to mitigate the negative effects of drought stress on plant growth, and manipulation of the crop microbiome is an emerging strategy for overcoming drought stress in agricultural systems, yet the effect of drought on the development of the root microbiome is poorly understood. Through 16S rRNA amplicon and metatranscriptome sequencing, as well as root metabolomics, we demonstrate that drought delays the development of the early sorghum root microbiome and causes increased abundance and activity of monoderm bacteria, which lack an outer cell membrane and contain thick cell walls. Our data suggest that altered plant metabolism and increased activity of bacterial ATP-binding cassette (ABC) transporter genes are correlated with these shifts in community composition. Finally, inoculation experiments with monoderm isolates indicate that increased colonization of the root during drought can positively impact plant growth. Collectively, these results demonstrate the role that drought plays in restructuring the root microbiome and highlight the importance of temporal sampling when studying plant-associated microbiomes.
干旱胁迫严重影响作物产量，预计下个世纪其严重程度和频率将有所增加。已有研究表明，一些根系细菌可以减轻干旱对植物生长的负面影响，并且，通过植物微生物组来调整产量已经成为克服农业系统干旱胁迫的新型方法，但是，干旱对根系微生物组建成的影响还是未知。通过16S扩增子和宏转录组测序、根系代谢组学等研究，我们发现干旱会延迟高粱早期根系微生物组的发展，并且导致革兰氏阳性菌（缺乏细胞外膜、细胞壁较厚）的丰度和活性增加。结果表明，微生物组群落结构改变使得植物代谢改变，并且和细菌ATP结合区（ABC）转运蛋白基因的活性增加有关。最后，用革兰氏阳性菌进行接种试验表明，在干旱胁迫下侵染植株根系可以对植物生长产生积极影响。本文证明了干旱对于根系微生物组的重塑作用，并强调了在研究植物微生物组的过程中，采样时间至关重要。
简介
植物微生物组对植物健康等方面发挥重要的作用，同时，植物微生物组的组成也受到许多和宿主相关的因素和环境因素的影响。近期研究表明，土壤可用水分的变化对植物相关微生物组具有显著的影响。由于干旱是影响农业生产力发展的重要障碍之一，并且其严重程度和发生频率在下个世纪甚至会有所增加，为保证全球粮食安全，改善世界作物对干旱胁迫的应对能力至关重要。和传统育种和基因工程方法相比，植物微生物组发展开发和在市场上推广的速度相对较快，并且可能为宿主带来更广泛的益处。然而，为了最大限度的利用微生物组提高植物耐旱性的效率，需要更具体的了解干旱胁迫导致的植物微生物组群落结构变化的原因和发生时间。
众所周知，干旱发生时间和持续时间会影响作物产量减少的程度，并且某些基因型的植物发育早期或晚期更容易受到干旱胁迫的影响。由于植物根系微生物组的建成主要发生在植物生长发育早期，我们假设植物微生物组也会受到因干旱发生时间不同所造成的影响，认为早期微生物组的形成最容易被干扰。我们的先前研究表明，干旱发生的事件确实会影响植物微生物组群落的变化程度，但是本研究中有限的时间采样使我们无法充分研究这一假设。在人类微生物组相关研究中，已有研究阐明了人类微生物组随时间变化的动态趋势，但是在植物研究中，即使有证据表明植物年龄是影响植物微生物组组成的决定因素，也很少有人在正常水分条件下的植物体系中进行高密度时间取样。
高粱是发展中国家的主要粮食作物，同时也是研究植物干旱反应的模式植物，在本研究中，我们证明了干旱显著延迟高粱根系微生物组的早期发育和形成。此外，结果显示对早期经受过干旱胁迫的植物进行二次浇水能使因干旱导致的微生物组发育延迟现象迅速恢复。可以观察到，干旱导致根系相关微生物组内多样性减少，并且几乎所有革兰氏阳性细菌相对丰度有所增加，这些细菌不同于革兰氏阴性菌，缺少细胞外膜并且通常具有较厚的细胞壁。结果表明，在根际，干旱下许多与特定氨基酸和碳水化合物相关的单体转运蛋白基因的转录水平增加，这说明干旱导致的根系代谢变化和很多根相关微生物组组成的变化相关。最后我们通过体内侵染实验，证明了干旱导致根系中一些革兰氏阳性细菌的侵染量增加，并且这种侵染和根系生物量的增加相关，特别是在干旱胁迫的情况下。因此，我们认为，干旱显著影响根系细菌的组成，并且以一种依赖时间的方式潜在的影响作物健康。
小知识：革兰氏阳性菌和阴性菌的区别
两者主要是细胞壁的结构不同。
革兰氏阳性菌的细胞壁，是一层厚而致密的肽聚糖和磷壁酸组成。肽聚糖的肽链之间通过5个甘氨酸交联着。
革兰氏阴性菌的细胞壁则是多层结构，从内到外依次是：薄薄的肽聚糖层，脂蛋白层/周质层，磷脂层和脂多糖层。革兰氏阴性菌的肽聚糖结构也和革兰氏阳性菌的有所不同，肽链是直接交联在一起的。
结果
干旱胁迫延缓高粱微生物组的发展
为了探究高粱发育对根系细菌群落的影响，并确定干旱如何影响微生物组的组装，我们在加利福尼亚州中部的科尔尼山谷进行了大规模田间试验，其中高粱植物每周采样一次，共17个时间点（TP1-TP17），用于研究各种植物和微生物性状。为了解释宿主干旱胁迫的品种特异性差异和微生物相关表型之间的潜在相互关系，我们选择了两种高粱（BT642和RT430），他们的耐旱表型不同（Fig S1）。我们假设干旱胁迫对早期根际微生物组的发育影响更大（相比于晚期），为了探究这一假设，我们将植物进行三种灌溉处理（Fig S2, S3）：（1）开花前期干旱胁迫，即在种植后到开花前期TP0-TP8这段时间无水分供应；（2）开花后期水分胁迫，即开花后TP10-TP17无水分供应；（3）对照，所有时期TP3-TP17正常水分供应。三种处理下，植株均直接种植在已经事先浇好水的田间，两周时间不加以处理让幼苗扎根并自由生长（TP0-TP2）。
Fig S1 两种基因型（BT642和RT430）高粱对照（左）和开花前期干旱胁迫（右）的植物表型
Fig S2 田间试验设计
（总分为18块地，三种灌溉处理三种颜色标识，R和B分别代表两个基因型，每块样地种10行，将近200株高粱，收集高粱的土壤、根际土以及根系样品。）
Fig S3 灌溉和采样时间
（图中17个时间点是否提供灌溉用黄色方块表示，TP1-TP17时间点的样品进行16S扩增子测序、TP8-TP9以及TP17样品进行宏代谢组分析；TP8-TP9样品进行宏转录组分析；TP8，9，17进行宏代谢组分析。）
为了确定三种处理所达到的干旱胁迫水平，我们对土壤可用水分（available soil moisture，ASM）消耗的百分比进行量化，这与植物根系可用水量相关。我们观察到两种干旱处理期间的植物ASM的消耗显著升高，然后在TP9恢复浇水时ASM恢复正常（Fig S4）。为了直接测定干旱对植物生理生长的影响，我们在整个实验过程中的一部分时间点测量作物水分胁迫指数（crop water stress index）代表着叶片蒸腾水平降低。这些数据表明，干旱胁迫的开花前处理组和开花后处理组都会导致植物胁迫程度增加（Fig S5）。据此我们可以观察到，与对照相比，开花前处理状态下的两种品种的植物株高都降低，直至实验结束才完全恢复（Fig. S6）。即使植物高度和蒸腾作用都发生了可测量的变化，但和对照组相比，两种基因型干旱处理后均未观察到作物产量的明显差异（Fig. S7）。最后，脱水蛋白基因（DS1和DS6）是已被证明是植物、高粱中的干旱胁迫分子标记基因，使用qPCR设计引物扩增其转录物，和对照组根系相比，开花前期干旱胁迫的根系样品表现出显著的过表达（时间点为干旱高峰期TP8，DS1: average log2-fold change = 12.7; P < 0.001 and DS6: average log2-fold change = 10.5; P < 0.001）。类似的，在开花后期干旱胁迫根系样品的高峰点（TP17）也能观察到两种基因的表达量增加，但相对较小（DS1: average log2-fold change = 5.2; P < 0.05 and DS6: average log2-fold change = 5.1; P < 0.05）（Table S1）。总的来说，这些数据表明，两种干旱处理都显著降低了宿主的土壤水分，并诱发植物应对干旱胁迫。
Fig S4 土壤可用水分消耗百分比
Fig S5 作物水分胁迫指数
Fig S6 两种基因型高粱整个时间段的株高变化
Fig S7 两种基因型高粱整个时间段的株高变化
为了确定干旱对植物相关微生物群落的影响，我们从幼苗萌发后七天开始（TP1），每周收集大量土壤、根际土和根系样品，一直到幼苗衰老（TP17）。使用16S rRNA基因的V3-V4区域进行Illumina MiSeq测序，针对每个样品的类型研究所有时间点细菌群落的组成(Fig. S3)。在植物幼苗发育期间（TP0-TP2），当三种水分处理相同时，根际和根系样品中的多样性在幼苗萌发后呈现快速增加的趋势（TP1-TP2），随后的一周内同样快速但是有所下降（Fig. 1 A–C）。这个结果和在经历内源异养演替（endogenous heterotrophic succession）的微生物群落中可观察到的系统发育多样性的变化一致，当有限的资源在某个中间时间段集中供应的时候，多样性在群落发展的中点处达到峰值。在这个最初的定殖期之后，干旱和对照组的比较表明，相对于对照组，干旱开花前处理和开花后处理均导致根系内生、根际微生物的Shannon多样性指数显著降低，相比之下，土壤中的的Shannon多样性指数水平基本保持不变（Fig. 1 A–C）。
Fig 1 | 干旱影响根系微生物组
（A-C三图分别代表三种处理土壤、根际、根内生部分在各个时间点的Shannon多样性变化，每条线的上方和下方阴影区域代表与平均值的标准偏差，垂直虚线划分的橙色和黄色区域分别代表干旱开花前处理时期和干旱开花后处理时期；D图显示所有对照和开花前干旱处理组样品的Bray Curtis距离的PCoA分析结果，组别见图例。每种形状的颜色代表浇水（绿色）或干旱处理（橙红色）的周数；E图按照时间点进行着色，代表对照组和开花前干旱胁迫组所有时间点的根系样品Bray Curtis距离的PCoA分析结果。TP1-TP17由不同颜色表示，初始时间点（TP1-TP2）为深灰色，早期时间点（TP3-TP8）为绿色，晚期时间点为蓝紫色（TP9-TP17）；F-H图，在对照、开花前干旱胁迫两种处理下时间点样品两两之间的Bray Curtis热图，绿色到粉色方块的渐变代表距离值由低到高，橙色和绿色线条分别代表干旱和对照处理的平均开花时间，黑线表示干旱结束时恢复水分供应。G图中左下角的红色矩形突出了TP3-TP8这一时期干旱处理导致样品和TP3这一时间点处理样品之间的强烈相似性。）
为了研究干旱前处理、植物基因型和植物年龄，和其他描述较为充分的因素（如样品类型）相比，对细菌群落组成的相对影响程度，进行了Bray Curtis - PCo分析。如图Fig1D，开花前干旱胁迫和对照组样品相比，根、根际和土壤分别聚集在三个部分中。另外，根据每周浇水或干旱处理的时间样品也能在图中分开。对于所有对照和开花前干旱处理样品，使用多因素方差分析（PERMANOVA）的方法进行组间差异统计。这些分析结果表明，细菌群落的样本类型、时间点以及干旱处理等因素影响很大（Fig S8），基因型和重复对群落组成无显著影响。由于基因型并不显著影响群落组成，所有剩余的16S rRNA分析将基因型作为两个额外的重复，放在一起进行分析。对于每种样品类型的分析使用单个的PCoA图进行展示，根系（Fig1E）、根际（FigS9A）以及土壤样品（FigS9B）三个类型可以看出，根系和根际群落动态变化比土壤明显，PCoA图中前两轴的解释率之和也更大（roots = 65.4%, rhizosphere = 54.2%）。该结果也表明，根系和根际样品之间呈现的“拱形”是微生物的环境特征，沿着环境或时间梯度产生高度转换，表明植物微生物组在这期间有着强烈的生态位分化，可能受到生物化学方面的影响。
Fig S8 基因型、样品类型和干旱处理对PERMANOVA指数的影响
Fig S9 根际土、土壤微生物组不同干旱处理条件下的PCoA分析结果
这些结果还表明，与对照相比，根和根际群落在干旱处理期间细菌群落发育停滞（Fig1E、Fig S9A），虽然微生物群落发育时间快慢存在差异，但这两组样品有着共同的趋势。这种延迟同样存在于所有时间点的干旱和对照处理的Bray Curtis热图中（Fig1G），在开花前干旱处理组中（TP3-TP8），干旱胁迫的植物根系样品的微生物组构成最接近于较年轻的对照组植物（Fig1G的红色矩形部分），说明根系微生物组的延迟转变可能是由于干旱胁迫导致植物发育速度减缓，因此我们观察到的开花前干旱处理导致开花时间延长、植物生长速率降低（FigS6）。然而在对照组的重复（Fig1F）与开花前干旱胁迫处理（Fig1H）的热图比较之间的群落结构差异表明，干旱对植物根系微生物组的影响超过了植物正常发育对微生物组的影响。
优势菌群的动态变化描述早期根系内生群落
为了更好的理解干旱对根系微生物组发育的延迟作用，我们首先试图了解正常灌溉处理条件下根系微生物组随时间的动态变化。在门的水平上，相对丰度变化显示，根系和根际群落早期招募菌群动态变化较大（TP1-TP6），而在后期相对稳定（Fig2A），这表明不仅仅是来源于周围的微生物组，根系内生菌同样有影响。据此，和试验后期周围土壤的微生物组相比，最初的六个时间点内根系和根际的微生物组相邻时间点之间表现出的组成差异相对较大（FigS10）。根系早期微生物组成的波动性是由大量的优势菌门水平上的相对丰度显著性变化所驱动的，包括放线菌、厚壁菌和变形菌门（Fig2E、FigS11），相比之下，发育后期（TP7-TP17）中最显著的门水平上的变化体现在较不优势富集的菌中（FigS11）。上述结果虽然表明根系微生物组后期发育较为稳定，但当使用更加精细的分类单元时，如科水平的一些变形菌门和放线菌门，整个实验过程中可以观察到它们在整个植物发育过程中按照时间重组的证据（FigS12）。
Fig 2 | 门水平上优势细菌类别的相对丰度变化
（ACE表示对照组，BDF表示开花前干旱处理组，在土壤、根际和根内生三个生态位，在所有17个时间点，在门水平上最丰富的前13个细菌门的相对丰度百分比变化情况）
Fig S10 土壤、根际和根系样品对照组相邻时间点菌群组成的平均BC距离变化程度
Fig S11 门水平上根系微生物组主要细菌门类早期动态变化
Fig S12 土壤、根际和根系中变形菌门和放线菌门的细菌在科水平上随时间的变化
为了确定对照组早期发育期间根系相对与土壤富集的细菌谱系，我们使用R包DESsq中的负二项模型来模拟可操作分类单元OTU水平上根内生和土壤群落在不同时间点（TP3-TP8）中的群落丰度。在含有OTUs的366个属中，根系和土壤之间存在着显著差异，35.5%在根系中表现出显著富集，FigS13系统发育树构建差异丰富的谱系，结果表明这种富集并非随机分布。在最丰富的八个门中，Proteobacteria, Bacteroidetes, Verrucomicrobia三个对根系环境表现出最高的总体偏好，如与土壤相比富集的百分比如FigS13B所示，均属于革兰氏阴性菌（diderm lineages）。在三种革兰氏阳性菌类的门Actinobacteria, Firmicutes, Chloroflexi中，后两种根富集比最低，在我们的分析中，只有Actinobacteria相对于其他的革兰氏阴性菌显示出中等水平的根部富集。因此这些结果表明，根系微生物组的早期发育是动态变化的，并且在许多优势类群中的变化较明显，当植物在正常浇水情况下，根系微生物组优先被革兰氏阴性细菌定殖。
Fig S13 TP3-TP8对照组土壤和根系样品中丰度存在显著差异的细菌属的系统发育图以及根系和土壤门水平上前八个丰度最高的细菌的百分比
干旱诱导早期根系内生群落富集革兰氏阳性菌
为了确定干旱如何影响根系微生物组的动态发育过程，我们接下来比较了开花前干旱处理组和对照组样品门水平上的组成分布。在开花前干旱处理组生长的根系中，我们观察到Actinobacteria， Firmicutes的富集，这与最近发表的相关研究结果一致，这可能也是本研究中观察到的根系样品中微生物多样性减少的一个因素（Fig2）。这种富集在六周的干旱处理过程中较为明显（Fig2）。有趣的是，在恢复水分供应的一周内，处理组织物根系微生物菌群迅速恢复到较早期对照组根系群落发展状态（Fig1E,G Fig2）。这种快速恢复诱导的根系内生群落组成变化是由于Proteobacteria和Bacteroidetes的相对丰度增加了200％以上（P < 0.001），并且革兰氏阳性菌Actinobacteria的相似大幅减少（P = 0.012）（Fig. 2）。由于放线菌门Actinobacteria的相对富集可能是由于其丰度的绝对值增加、或者是其他优势品种丰度的绝对值减少所致，我们使用特异性引物通过qPCR测量干旱和对照组根系样品中，及各类别的绝对丰度。该结果表明，田间试验中，干旱处理导致细菌丰度的总量降低，但和Proteobacteria相比，Actinobacteria和Firmicutes对这些转变显示出显著更大的抗性（Fig. S14）。此外，观察到在干旱高峰期（Fig. S14A）与干旱处理早期（Fig. S14B）相比，所有群落成员降低的幅度更大，这表明绝对丰度的减少和干旱处理的长度有关。总之这些结果表明，田间生长的高粱根系微生物组成对植物发育早期的干旱扰动敏感，并且这种扰动导致总细菌群落的丰度降低，且在门水平上选择革兰氏阳性细菌的相对丰度降低。
Fig S14 TP8和TP4两个时间点根系样品qPCR结果
为了在更高的分类单元上鉴定对照组和开花前干旱处理组相对丰度存在差异的特殊细菌，我们使用先前分析中用过的负二项是模型来选择在干旱、对照处理中富集或减少的OTU。在开花前期（TP3-TP8），根内生植物中观察到的390个属中的195个共有1029个OTU被认为是对照和处理组之间相对丰度存在显著变化的类别，包括66个干旱条件下富集的菌以及129个干旱条件下减少的属。从根系差异丰富的属中挑选代表性16S rRNA OTU 序列构建系统发育树（Fig3），提供进一步结果，表明干旱富集的分类单元在系统发育上也高度聚类，几乎全部属于革兰氏阳性菌（ monoderm phyla）（Fig. S15）。在讨论中，我们详细阐述了这个pattern下的几个值得注意的例外情况（在图3中用*号表明）。含有OTU的属在干旱条件下根系、根际和土壤中的显著变化产生了类似的富集和减少的系统发育模式（Fig. S16A）；254个属中只有18个在三种样本类型中都有相反的富集和减少模式（Fig. S16B）。然而在剩下的236个三个生态位中富集模式不相同的OTU中，具有显著变化的细菌在土壤的总数和变化幅度始终低于根系或根际（Fig. S16）。
Fig 3 | 所有干旱下差异的属进化树。
每个属选择一个代表性序列，内部颜色为门，中间颜色代表革兰氏分类，外圈柱为log2差异倍数，红色为富含，蓝色为下降。星号内容见讨论。
Fig S15 TP8时间点下六个在门水平上富集的细菌对照和处理组百分比
Fig S16 干旱条件下根系、根际和土壤OTU相对丰度的变化热图
由于上面进行的微生物群落分析是基于单个田间试验结果，下面我们测试其他环境中是否也可以观察到干旱条件下革兰氏阳性菌的富集。为此我们在加州伯克利的野外站进行了较小的类似实验，得到数据并加以分析。其中开花前干旱处理和对照组处理生长的两个基因型高粱植物每周采样，共12个时间点，进行微生物组群落分析。根据加州科尔尼的主要实验数据，在伯克利的实验数据中，观察到干旱条件下富集的类别以及革兰氏阳性菌的富集（Fig. S17 A and B）。类似的，尽管不如科尔尼田间试验结果显著，我们也观察到干旱条件下根中的放线菌的相对丰度增加（TP5-TP12，Fig. S17B）。这种显著性的降低可能是由于干旱处理时间不同，这里是从发育后期（第五周）开始的，或者是由于伯克利试验中土壤水分消耗较低（Fig. S18）。这些结果在广义上说明，我们在干旱条件下观察到的革兰氏阳性菌的富集在多数情况下是常见的，这可能和胁迫程度和时间等因素有关。
Fig S17 伯克利田间试验组TP9-TP12对照和处理组存在显著变化的OTU系统发育图以及根系、根际和根内生三个生态位相对丰度变化最大的13个类别
Fig S18 伯克利和科尔尼两地土壤湿度变化记录
早期干旱比晚期干旱造成根系群落更大的影响
我们假设在早期植物发育过程中优先建立菌群，在较老的植物根部微生物组对干旱胁迫敏感性较低。为了验证这一点，我们对科尔尼同一季节种植的植物每周采集的植物开花后干旱胁迫组样品进行分析。如前所述，开花后期干旱和对照组群落比较来看，和开花前干旱处理组类似，干旱条件下根和根际Shannon指数降低，土壤中无明显表变化（Fig. 1 A–C）。然而在门水平上的相对丰度结果揭示了，在开花后期根系微生物群落相对稳定并且和对照组相似（Fig. S19）。开花后胁迫和对照组的样品PCoA分析表明，和开花前干旱胁迫相比，处理组相对缺乏聚类，特别是根系和根际样品（Fig. S20）。类似的，PERMANOVA揭示了后期干旱处理所解释的变异量小于开花前干旱处理所解释的变异量（Fig. S8 and Tables S2–S5）。最后，干旱和对照处理的根系之间的平均Bray Curtis差异的分析显示，在干旱处理的第一周之后，与对照相比，开花前干旱处理比在随后的每个时间点的后期干旱处理具有更大的差异（Fig. S21）。 这些结果表明，与早期植物发育中观察到的类似，尽管在植物发育后期发生的干旱伴随着微生物多样性的减少，但它对根微生物群落组成的影响显著较小。
Fig S19 三种干旱胁迫处理下，门水平丰度前13个的细菌的相对丰度变化
Fig S20 开花前干旱胁迫和开花后干旱胁迫的PCoA分析结果
Fig S21 开花前后干旱处理与对照组相比不同时间点的群落变化
为了探究开花前干旱处理和开花后干旱处理两种状态下OTU表现出的丰度变化的重叠，我们通过负二项模型确定了TP10-TP17（n = 1,059）期间后干旱处理和对照组之间显著变化的OTU。将此与开花前干旱处理与对照组相比的差异OTU（TP3-TP8，n = 1,029）列表进行比较，我们发现，虽然在门水平上整体分布模式和每个门的OTU总数似乎相似（Fig. S22A），两组中超过一半的OTU仅在两种处理中的一种中显着改变（Fig. S22B）。需要注意的是，只在开花前期干旱处理中改变的OTU在所有根系样品中的序列总数是干旱后期处理组的三倍（preflowering = 20.7%, postflowering = 6.4%）。这一结果可以解释为什么在后期干旱中虽然具有不同丰度的OTU数量很大，但对群落组成的影响相对较小。数据还表明，两种处理中显著变化的OTU占根系样品总数的67.6%（Fig. S22C）。此外，比较在开花前后干旱处理共同富集的OTU，结果显示两种处理中干旱下富集的OTU中98％（n = 41/42）属于革兰氏阳性菌，而94％（n = 131） 在这两种处理中减少的OTU都是革兰氏阴性菌。总体来看，结果表明，虽然开花前后干旱处理表现的富集革兰氏阳性菌在系统发育上模式较为保守，但是他们响应的数量不同，并且特定的OTU表现出丰度的变化。
Fig S22 不同处理组间OTUs的相对丰度变化不同
干旱处理下根际放线菌转录水平增加
为了确定开花前干旱处理期间根系相关微生物组组成变化是否和微生物组的功能变化相关，我们对开花前干旱胁迫（TP8）和恢复浇水（TP9）后的峰值处的根际、土壤群落进行宏转录组测序。与扩增子数据一样，来自两种基因型的样品显示高度相关性，并且在所有后续分析中，我们将这两种基因型视为额外的重复。在我们的数据集中的556,826个基因中，我们在根际鉴定了13,300个干旱富集基因（DEG）（占DEG总数的61%），相比之下，只有4,685个基因在土壤干旱条件下显示富集（占土壤总DEG的12％），出乎意料的是，在土壤和根际干旱条件下都富集的基因只有1,457个（Fig. S23）。
Fig S23 韦恩图表明对照组和开花前干旱胁迫对土壤和根际样品差异基因表达数量
根据我们的扩增子分析结果，在对所有转录物的全局分析中，我们观察到根际干旱期间放线菌转录物表达的显着增加（Fig. 4A），反映了16S rRNA数据的相对丰度有所增加（Fig. 2C and D）。这些结果表明，通过孢子计数不足以描述放线菌丰度的增加，这将导致大部分休眠细胞的转录活性降低。与根际相反，类似分析显示土壤中的放线菌转录物没有增加，但确实看到属于厚壁菌门（另一种革兰氏阳性菌）的转录物的表达增加（Fig. 4A）。由于全球宏转录组分类学数据分析可能存在偏差的影响，并非所有基因在数据库中表现均等并且有较好的系统发育标记基因，我们仅使用一组9个相似的核心基因（gyrA, recA, rpoB, rpoA, gyrB, gap, rho, ftsZ, and secA）（Fig. S24）。在根际土壤中，相对丰度显示出大致相似的模式，包括干旱处理下的放线菌的核心基因转录物的大量富集，其在恢复水分时减少。然而，与全局分析相比，这一分析确实揭示了一些差异，例如，先前观察到的干旱处理土壤中厚壁菌门Firmicutes细菌转录物的增加在核心基因分析中没有出现。相对于全局分析而言，在所有时间点和所有处理组中，Firmicutes转录本的相对丰度均显著降低，我们这种差异可能是因为在我们的分类数据库中Firmicutes的这九个基因相对缺乏。总之，这些结果表明，虽然根际和土壤相关的微生物群落在分类学特征方面可能对干旱胁迫的反应相似，但它们在表现出差异表达的基因的数量和类型方面的反应不同。 该结果类似于先前在16S rRNA基因数据集（Fig. S16）中差异丰度比较中观察到的结果，其中，在系统发育分析上，干旱处理的根和土壤产生类似的OTU富集和减少，但是这些变化的数量和大小有所差异。
Fig 4 | 干旱影响根系微生物组的转录
（A，宏转录组数据中门的水平上前13个细菌的相对丰度百分比，干旱处理和对照组两两对比，左边是根际土右边是土壤；B，对于在TP8下根际土壤（左）和土壤（右）的干旱下显示富集的所有基因的GO富集分析。 x轴上的值表示在每个类别中在干旱下上调的基因的相对百分比，相对于整个数据集内相应类别中基因的总相对百分比的倍数富集比。省略了少于5个差异表达基因的类别。红色圆圈表示在测试中P值< 0.05的类别（* P ≤ 0.05; * P ≤ 0.01; ** P ≤ 0.001）。C，所有13个门的转录本相对丰度，并根据GO分别（y轴）表示TP8和TP9根际土（左）和土壤（右）处理的差异表达。省略了少于5个差异表达基因的类别。 每个门使用的颜色图例如图2所示。
Fig S24 九个核心细菌基因确定的前13个细菌门类相对丰度图
干旱增加与代谢物运输相关的放线菌转录
接下来我们试图探究由干旱引起的，根际处理下特定细菌功能表达相关的变化。在根际，我们观察到与碳水化合物转运和代谢，氨基酸转运和代谢以及次级代谢物生物合成相关的转录物中干旱峰值（TP8）显着增加，相比之下，土壤在所有这三个类别中表现出相对减少，并且富集了一系列独特的功能，包括能量产生，转录和翻译后修饰（Fig. 4B）。此外，我们观察到在干旱和水分恢复（TP9）后，干旱下表现出富集的基因类别发生了变化（ Fig. S25A）。根据干旱条件下，TP8影响的根际菌群功能亚类的更高水平上的分析显示，最显著富集的基因功能与资源转运有关，包括两种氨基酸的转移（33个中的10个; Fisher精确检验：P < 0.039），和碳水化合物（50个中的11个，Fisher的精确检验：P < 0.0005）。尽管，值得注意的是，ATP结合盒（ABC）型转运蛋白是三组分系统，这可能是人为地放大了这种观察到的富集。根据我们对宏转录组数据的分类学分析，结果显示，所有功能类别中根际的大部分DEG（~90％）属于放线菌，而土壤群落中约为50％（Fig. 4C）。最后，为了确定碳水化合物和氨基酸转运和代谢基因本体（GO）类别的富集是否仅仅是放线菌的相对丰度增加或者放线菌功能的转变的结果，我们对所有放线菌转录物的分类以及GO功能进行了分析（Fig. S25B）。该分析表明干旱引起的根际功能的变化是由几乎所有GO功能类别的放线菌谱系内基因表达的显着变化，碳水化合物和氨基酸转运和代谢，以及ABC转运蛋白的表达增加所驱动的（Fig. S25C）。总之，这些数据表明干旱对根相关微生物组的转录活性具有显着影响，与碳水化合物和氨基酸代谢和转运相关的根际基因在干旱下表现出增加的表达，并且根际转录活性发生改变。干旱期间的微生物组主要是由于放线菌活性和功能的变化。
Fig S25 干旱条件下功能基因富集类别
干旱诱导根系代谢转变与根际转录活性的改变相关
为了研究干旱引起的根际微生物组转录活性的变化，特别是碳水化合物和氨基酸转运蛋白表达的增加是否与高粱根代谢的变化相关，我们使用气相色谱 - 质谱（GC-MS），分别在干旱期间（TP8）和恢复水分供应（TP9）两个时间点，对高粱根进行了非靶向代谢组学研究。通过对处理组的比较分析，我们鉴定了大量可识别的富含干旱的根代谢物（n = 114），包括各种碳水化合物和氨基酸（SI附录，表S11）。 最显着富集的代谢物是甘油-3-磷酸（G3P），与对照组相比，其在干旱处理中根系富含4.34倍（自然对数值）。有趣的是，在根际宏转录组分析中，干旱条件下显著富集的碳水化合物基因亚类中，我们观察到G3P的ABC型转运蛋白的强烈富集，G3P在数据集中具有最大数量的上调基因（ n = 191; P = 0.0001328）。
由于根中观察到的G3P的增加可能是由系统中的植物或微生物产生的，我们对干旱处理后的非生长高粱幼苗根中的G3P水平进行了高效液相色谱（HPLC）分析。这些结果表明，与对照相比，在没有微生物的情况下，G3P分别在暴露于干旱2周和4周的根中产生两倍和100倍的水平（Fig. S26）。为了进一步证明G3P富集是宿主产生的，我们用引物进行qPCR，所述引物设计用于量化在干旱峰期（TP8）期间收集的田间生长的根样品中G3P转运和分解代谢途径中的几个基因的表达。这些结果揭示了参与植物细胞质膜G3P转运的基因（G3PP）显着增加，负责将G3P转化为其他产物[磷酸二羟丙酮（DHAP）和角质生物合成的前体的 cGPDH（胞质甘油-3-磷酸脱氢酶）和GPAT6两个基因（甘油-3-磷酸酰基转移酶6)显著减少。这些观察结果与G3P在植物根组织内的干旱下积累并随后转运到质外体中的模型一致，可能有助于减少细胞面临的氧化应激（Fig. S27）。此外，代谢组学数据表明干旱导致根内的各种其他碳水化合物和氨基酸的积累，并且其中许多具有潜在相关的基因类别，在根际中具有显着的富集，包括核糖，天冬酰胺，脯氨酸，麦芽糖，葡萄糖和苏氨酸。值得注意的是，在开花后干旱处理的峰值发现干旱和对照（n = 7）之间差异地富集的代谢物大量减少，并且G3P不在其中。我们还观察到，在TP17的开花后干旱处理根中放线菌的相对富集比在TP8的开花前干旱处理根系中富集的大约低三倍。总之，这些结果表明，在干旱胁迫下富集的多种根代谢物可以被根系相关的放线菌利用，并且与晚期发育相比，干旱引起的早期群落结构变化相对较大，相应地植物代谢组的变化较大。
Fig S26 高粱根系G3P基因相对丰度的变化
Fig S27 在干旱期间G3P分解代谢和运输途径中宿主根转录物的负调节模型
干旱条件下根系富集放线菌
无菌定殖实验+qPCR定量细菌绝对数量
田间试验数据结果表明，干旱期间放线菌的丰度增加可能部分是由于大多数其他细菌谱系的绝对消耗较大，但不排除植物通过目前还不知道的某种机制直接选择。为了更好地区分这些潜在的富集原因，并确定干旱下的放线菌富集是否有助于宿主表型的变化，我们在无菌土壤中生长的植物中进行了受控的接种实验。在这些实验中，将培育自田间生长的干旱胁迫的高粱根的单个细菌单独施用于含有预灭菌土壤的2日龄灭菌的高粱幼苗。选择三种细菌，包括作为干旱处理后显著富集的两种代表性放线菌菌株（Streptomyces coelicolor Sc1 和 Streptomyces ambofaciens Sc2）一种作为干旱处理后显著减少的代表性变形菌（Pseudomonas syringae Ps1）用于该实验。为了对干旱胁迫两周后微生物的定殖水平进行量化，我们用对放线菌或变形菌门特异的引物进行qPCR。与从田间生长的样品中获得的qPCR结果相反，我们观察到与对照根相比，两种放线菌菌株在干旱处理的根中显示出大约两倍的丰度增加（Fig. S28）。相比之下，Proteobacteria的丰度减少了大约三倍。为了证实在干旱期间增加的放线菌的根定殖，我们用mCherry荧光基因标记链霉菌分离株Sc1和Sc2，并使用共聚焦显微镜在干旱和对照处理期间对根组织的定殖进行成像，如上所述进行接种实验。我们观察到，与对照相比，荧光密度表明两种标记菌株在干旱后显示出大约两倍更高的定殖水平（Fig. S29）。类似地，用PEG 6000（一种通常模拟干旱造成渗透胁迫的替代物）处理植物，与对照相比也显示出显着增加的定殖（Fig. S30）。这些结果表明，在没有来自其他微生物的竞争下，个体放线菌在干旱下可以具有绝对富集，这表明单独的生态位扩展不可能完全解释观察到的现象。出乎意料的是，两种菌株在接种后也诱导了根生长的适度但显着的增加，并且这种生长促进仅在暴露于干旱处理后可观察到（Fig. S31）。总之，这些数据表明，在受控的实验室环境中以及在没有其他微生物的情况下，观察到的干旱期间放线菌丰度的增加伴随着定植的增加，并且这种增加可能有益于植物健康。
Fig 5 | 干旱影响根系微生物组的转录
（在干旱下，链霉菌Streptomyces在高粱根系定殖增加。 共焦荧光（A1和A3）和亮视野（A2和A4）成像mCherry标记的链霉菌属菌株Sc1在基因型RTx430的对照（上部）和干旱处理的（下部）根上的定殖。（比例尺：50μm）；使用共聚焦荧光显微镜在24个对照（绿色）和24个干旱处理（橙色）根样品上测量荧光强度的小提琴图。）
Fig S28 使用特异性引物进行qPCR观察接种三种细菌对照和干旱条件下的无菌高粱根系生长情况
Fig S29 干旱条件下观察mCherry标记的菌株Sc2
Fig S30 在PEG处理下观察mCherry标记的菌株Sc1
讨论
我们的研究在多个层面上解释了植物发育和干旱胁迫对于高粱根系微生物组的影响。在早期发育期间，我们证明了高粱根系内部微生物的较高动态变化，并证明了正常生长条件下，早期发育阶段植物根系招募更多的革兰氏阴性菌，尤其是Proteobacteria 和 Bacteroidetes，富集更加明显。然而，微生物共存必然要达到一种平衡，有周微的生物和非生物环境决定不同条件下的不同类别微生物具有不同的适应性。因此我们提出，在根系、根际以及充分浇水条件下，革兰氏阴性菌的定殖能力较强，而在干旱等胁迫压力下则不适宜存活。在其他微观和宏观生态系统中，随着时间出现的环境波动对群落组成的例子也存在。
与先前结果相反，来自田间试验的根系样品在干旱处理后表现出放线菌相对丰度显著降低，随着干旱的进展，这种变化越发显著。然而，在生殖生长期的高粱中接种单个放线菌后的干旱处理显示导致放线菌丰度的绝对增加。在研究干旱对土壤中总细菌丰度影响的研究中也观察到了类似的差异。一般来说，在干旱条件下观察到总生物量减少，但一些研究表明，细菌丰度保持不变或甚至增加。各种混杂因素可能导致这些不一致，包括干旱处理的持续时间和强度，温度，土壤pH值和物理化学等土壤因素，养分可用性和测量方法。
尽管在本研究中观察到绝对丰度的差异，但在野外和实验室实验之间，相对丰度的普遍模式仍然保持一致。特别是，在野外或实验室无菌体系下变形菌的绝对丰度的大量减少和放线菌的增加与我们的扩增子数据集中观察到的这些类别的相对丰度所观察到的变化一致。
本研究中未曾预料到的一个结果是根系微生物组所呈现出的弹性变化程度，在恢复浇水的一周内，完成了优势菌从革兰氏阳性菌转变回革兰氏阴性菌的显著变化。对于其他微生物群落的恢复研究发现，受到短期或长期干扰事件影响的微生物组（包括土壤，海洋和宿主相关微生物组），只有不到一半能够进行成功的恢复。在我们的研究中，这种弹性可能是由于，一些革兰氏阴性菌生长速度较快，这可能使得一些幸存的革兰氏阴性菌在导致他们相对丰度降低的胁迫解除后直接恢复到先前水平。
虽然在干旱条件下革兰氏阳性菌为何富集的原因还是未知的，但是几个类别的意外富集和减少模式（Fig3，星号），表明这种现象与肽聚糖细胞壁层的结构和厚度有关。特例之一的Actinoplanes是一种放线菌，最近已被证明具有新的细胞壁类型，与大多数其他类放线菌相比，肽聚糖结构有相当大的改变。在变形菌（Proteobacteria）内，一种在干旱条件下具有强烈的几乎排他性减少的革兰氏阴性菌，其中一些成员，如Chromatiales目和Myxococcaceae科最近都显示肽聚糖细胞壁内具有额外或不寻常的结构；相应的，我们观察到干旱条件下二者显著富集。类似地，属于Nitrospira的OTU，一种含有三层细胞壁的非典型革兰氏阴性菌，在干旱时也表现出富集。最后，Chloroflexi门的成员，最近研究显示含有细胞壁和没有细胞壁的两类，富集和减少的数量相当。这些观察结果表明，虽然根系微生物组内干旱诱导的富集很大程度上遵循个体和类别之间的趋势，但是真正的区别因素可能是在于是否存在细胞壁，细胞壁的厚度和结构以及是否存在外膜。由于细菌细胞壁的结构仅仅针对少数细菌分类群进行了详尽的描述，因此需要进一步探索不同类别的细胞壁组成。
最近的证据表明，特定植物代谢物的渗出可以影响根微生物组成，并且代谢物的变化驱动植物正常发育并且与植物相关微生物组的变化相关。干旱下与细胞壁结构相关的革兰氏阳性菌富集的一个可能原因就是植物产生过量的G3P(Fig. 6)。在我们的接种实验中观察到的短期干旱后，放线菌的绝对富集，其中根仅仅接种于单一微生物菌株，与某种形式的阳性对照一致。虽然干旱引起的大多数其他氨基酸和糖的产量增加并未提供对放线菌特异性增加的明确解释，但G3P是肽聚糖生物合成的重要前体，肽聚糖生物合成是细菌细胞壁的主要成分，使单酯中肽聚糖层的平均厚度增加。我们注意到，在根际微生物组中与G3P相关的ABC转运蛋白和代谢途径中，干旱期间活性增加，其中大部分（98％）特别属于放线菌。基于这些结果，可以想象植物根中G3P的过量产生可能导致该代谢物渗出到根际和质外体中，其中它被Actinobacteria用于促进其生长。
Fig 6 | 干旱条件下根系相关微生物组选择革兰氏阳性菌的模型
（1、早期给植物根系发育过程中，在正常的灌溉模式下，选择革兰氏阴性菌(diderm，双层膜)；2、干旱引起植物根系代谢的变化，包括一系列碳水化合物，次级代谢产物和氨基酸的增加。 这些变化导致这些和可能的其他代谢物的渗出，这反过来又支持特定菌群的生长。 此外，通过尚未知的机制进行的负选择导致所有细菌的绝对丰度降低，但对具有革兰氏阴性菌细胞壁特征的细菌的负选择更强烈；3、恢复水分供应导致代谢物介导的和其他未知选择压力的释放，允许革兰氏阴性菌快速生长并恢复在对照条件下观察到的根微生物组发育和活动的模式）
然而，我们预计单独的正选择压力不可能完全解释革兰氏阳性菌相对丰度的增加，有两个原因，首先，仅在放线菌中观察到G3P相关转录物的增加，因此不能解释其他类别的革兰氏阳性菌（如 Firmicutes and Chloroflexi）相对丰度的增加。其次，我们来自田间土壤群落的实验证据表明，与革兰氏阳性菌相比，干旱导致革兰氏阴性菌的绝对损失更大，事实上我们测试的所有细菌类型均显示出了降低的结果。基于这个结果，似乎合理的解释是由于宿主或其他微生物产生的化合物对革兰氏阴性菌产生了复选择驱动。已知，放线菌本身可产生多种抗微生物剂，并且许多这些化合物在特定的环境因素后被诱导。实际上，我们观察到干旱导致聚酮化合物合成酶和细胞色素P450基因的活性增加，这两者都参与抗生素等次级代谢产物的生产。然而，大多数抗生素通过抑制细胞壁的生物合成起作用，不能保护它们的外膜，并且通常对革兰氏阳性菌的生长有更大的负面作用。或者，已知植物组织在干旱下经历活性氧物质（ROS）显着增加，并且与革兰氏阴性菌相比，革兰氏阳性菌对ROS的存在表现出更大的抗性。对于这种现象，已经提出革兰氏阴性菌的外膜对活性氧损伤的敏感性，以及单层细胞壁中较厚的细胞壁提供的相对较大的保护作用。为了支持这一假设，我们认为，恢复水分供应后，ROS通常会在短时间内降低，革兰氏阴性菌的迅速增加可以缓解这种负选择。对ROS清除受损或增强的植物的进一步实验可能有助于检验这一假设。
最近一项关于干旱对30个被子植物微生物组影响的研究发现，植物根系中链霉菌属的相对丰度与宿主耐旱性之间存在显着相关性。根据这一点，我们观察到干旱胁迫不仅增加了根和根际内的链霉菌分离株的定殖，而且这种定殖可以增加干旱期间的根发育。 在我们的研究中，细菌接种与枝条鲜重的变化无关，表明微生物诱导的相对根 - 茎资源分配的增加在整个干旱胁迫期间有益于植物整体适应性的提高。然而为了确定这种趋势，我们需要进一步对各种革兰氏阳性菌进行额外的实验，并且在不同的土壤环境中进行。
结论
对作物微生物组的研究有希望成为解决干旱对农业生产力带来的许多挑战的策略。 然而，为了充分利用这一潜力，需要更好地了解干旱引起的土壤和作物微生物群变化的原因，后果和时间。 该研究表明，干旱显著改变了根微生物组成和功能，尤其是在早期发育过程中。在研究植物相关微生物组时，时间采样的重要性至关重要。
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