NBT：根际微生物组结构改变使番茄具有抗青枯病性
今天跟大家分享一篇最近发表在NBT上关于根系微生物组的文章。
首先，我们来了解一下文章的作者。这篇文章的工作是由来自韩国的两个课题组共同完成的。通讯作者包括两位，一位是来自延世大学的Kim， Kim的研究工作主要集中于基因组，另一位作者Lee来自东亚大学，之前参与过一项植物抗病相关的研究，发现了一种能够帮助番茄抵抗晚期枯萎病的真菌。
接下来，我们先看一下研究背景。肠道微生物也就是我们所说的“肠道菌群”，其数量超过人体自身细胞，对营养物质代谢、人体自身发育、免疫及疾病的产生等方面都起到极其重要的作用。许多研究者通过对健康人和患者之间的肠道菌群进行详细比较后发现，肠道微生物和多种疾病直接相关，比如肠道中的益生菌能够减少某些类型癌症的风险，减缓甚至阻止帕金森病的进展，可以通过调控或影响淋巴T细胞和B细胞的活性帮助人体调节失衡的免疫功能，防止出现炎症等。与肠道菌群类似，植物根系也存在着种类繁多的微生物，包括益生菌和病原菌等，而植物的免疫系统也会对这些外来的客人产生不同的响应。已有研究发现，调控免疫系统的相关基因会影响植物根系微生物的组成，添加不同的微生物也会影响免疫系统相关基因表达量的变化，许多能够帮助植物抗病的细菌、真菌也相继被发现，表明植物免疫系统和根系微生物之间是相互影响的。
据了解，这篇文章的工作开始于5年前，作者基于在拟南芥中SA能够影响根系微生物组的发现，想进一步了解根系微生物组在植物抵抗病原菌方面的作用。所以，这篇文章的科学问题是在植物发病过程中，微生物组的结构和功能是什么？这些跟植物相关的微生物是否参与了抗病过程呢？
针对这些科学问题，作者设计了如下的实验。首先，作者选择了番茄作为研究对象，番茄是茄科植物，因其具有生长周期短、基因组小、遗传背景较清楚、易于遗传转化等优势，是研究抗病机理的模式植物。而青枯病是番茄的一种重要病害，它是由Ralstonia简称青枯菌所引起的一种毁灭性土传病害，青枯菌可从植物根部，或茎的基部侵入植株导管系统，通过增殖和一系列生化活动堵塞或损坏寄主维管束输导组织，导致植株失水枯萎，引起植株发病。目前被认为的主要的致病因子是胞外多糖，胞外多糖是青枯菌在培养基上和植物体内生长过程中分泌大量粘性物质的重要成分，它可能保护青枯菌避开了植物组织中或环境中的有毒物质，随着青枯菌的繁殖而增多,进而直接阻碍了植物蒸腾作用的水分运输，也可能是EPS覆盖了青枯菌细胞表面的植物细胞识别基团，防止寄主可能发生应答反应如过敏性坏死反应等。青枯菌的寄主范围广，涉及多达200多种植物，其中番茄、烟草、马铃薯最严重。基于农业生产和生态学意义，作者对番茄青枯病展开了研究。首先，作者选择了两个番茄品种，一种是对青枯菌具有抗性的品种Hawaii 7996以及易受青枯菌侵染的品种Moneymaker。通过16S以及宏基因组测序的方法，对两种番茄的根际微生物组进行了比较。通过将抗性品种的根际微生物移植到非抗性品种根际的实验，试图验证微生物是否参与植物对病原菌的抗性。通过基因组组装、分析，采用特殊的培养方式以获得抗病品种富集的候选菌，并进一步验证候选菌是否在植物对病原菌的抗性方面产生作用。基本思路可分为3步：寻找差异菌，培养差异菌，验证差异菌功能。通过以上实验，作者得到了以下结论。需要提前说明一下，文章的附图大部分是压缩版本，原图没办法看清楚，所以只能请大家凑合看一下~
结论1，抗病品种Hawaii7996和易感品种Moneymaker的根际微生物有差异。作者分别在塑料大棚和温室进行了番茄的种植。在塑料大棚的系统中，作者将两个番茄品种以及洋白菜随机种植，并在植株活跃生长的开花期和成熟期两个时期分别取样，对其微生物组进行了16S测序。PCoA图中可以看出，土壤中的微生物与植物根际的微生物明显不同，绿色代表的洋白菜和下方的番茄微生物也不同，这是物种之间的差异，两个番茄品种的微生物组是有差异的，但取样时间引起的差异更明显。通过计算α多样性发现，土壤中微生物的多样性高于植物根际，而植株第二次取样也就是成熟期的根际微生物组多样性高于开花期。进一步通过对两个番茄品种第一次收样时的微生物组在class（纲）和family（科）水平上进行比较后发现，7996特异性的富集了黄杆菌、鞘脂单胞菌、假单胞菌，而moneymaker特异富集了一些α-，β-变形菌。
另一方面，作者进行了盆栽实验，将塑料大棚中的土壤装入盆中放在可控温控湿的温室中种植了两个番茄品种，得到了与塑料大棚实验中相似的结果。考虑到在16S测序过程中，PCR产生的偏好性，作者对第一次收取样品的微生物组进行了宏基因组测序，也与16S测序结果相吻合。通过多组实验、多种测序方法证明了抗病品种7996和易感品种moneymaker的根际微生物存在差异。并且发现，在抗病品种中特异性的富集一类细菌——黄杆菌。
结论2，将抗性品种的根际微生物移植到非抗性品种根际能够缓解植株的疾病症状。通过盆栽移植，作者进行了两个番茄品种根际微生物互换实验，简单来说，就是将抗病品种移植到之前种过易感品种的土中，将易感品种移植到之前种过抗病品种的土中。结果发现，从发病症状来看，易感品种在易感土壤中发病症状最强，移植进抗病品种的土中会缓解症状。这些结果表明，种过抗病品种的土壤确实影响了易感品种的发病，而原因有可能是抗病品种分泌到土中具有抗病原菌作用的分泌物，也有可能是抗病品种特异性富集了一些有益微生物。为了证明第一种可能，作者首先将抗病品种的分泌物与青枯菌共培养，但是不论在培养基加糖不加糖的条件下，分泌物都没有抑制青枯菌的生长，所以作者想进一步验证是否是微生物的作用产生了抗病的功能呢？作者收取了两个品种的根系样品，通过梯度稀释、平板培养，分离到了447株细菌，并在其中得到了31株对番茄有促生或抗病作用的黄杆菌。但是，不论是只将这些黄杆菌与青枯菌共培养还是在植物中加入这些菌，都没有看到抑菌和抗病的作用。既然16S和宏基因组数据都明显地显示了黄杆菌在抗病品种根际的富集，那它的存在应该有一定的意义，可能作者做了多种尝试，比如常规的增加黄杆菌的加入量、改变培养基成分等优化体系的方法都没有达到理想的效果，或者换种思路，尝试验证其它差异菌的功能，但是这样不能从根本上解决问题，即使是相同的16S，细菌的性质也有很大差异，作者考虑到可能是细菌分离培养技术的限制，导致未分到具有抗病功能的黄杆菌，所以作者开始从基因组数据中挖掘信息。
通过宏基因组的数据比较发现，相对于易感品种，抗病品种7996富集了一类GC含量位于30-40%的DNA，主要是Bacteroidetes拟杆菌门。黄杆菌属于拟杆菌门，在这些DNA片段中，作者重构出了一个假设的黄杆菌基因组，除了16S片段外大小约4.1M，命名为TRG1，这是第一次从番茄根际宏基因组中组装微生物基因组，同时将新构建的TRG1与255个已知的黄杆菌基因组进行比对后发现，它跟一种泥滩杆菌的基因组很相似，TRG1很有可能是一种新的黄杆菌分类学分支。作者将TRG1和两种黄杆菌的基因组分别在两个品种的宏基因组数据中比较后发现，TRG1在抗病品种中的丰度远高于易感品种，表明抗病品种富集了这类菌，通过基因功能分析后发现，TRG1基因组中包含了糖类利用、铁摄取、多种酶合成以及多种糖类物质转运的功能基因，这些基因很有可能有助于这种菌促进植物生长及抗病。
作者试图分离拥有TRG1基因组的黄杆菌，将其命名为TRM1。首先，在之前的分离方法中未能分离到这种菌，很有可能这种菌需要特殊的培养基或者培养条件。参考TRG1基因组数据，发现TRM1和8种海洋细菌处在同一分类学分支，同时这种菌很可能只利用D-甘露糖作为碳源，以及具有抗卡那霉素的作用，所以作者利用稀释10倍的含有2% NaCl的海洋培养基，添加特殊碳源和卡那霉素，分离到了22株TRM1候选菌。通过TRG1基因组信息设计了3个片段大小不同的特异性引物，利用PCR扩增，证明了这22株菌都具有TRM1的基因组信息。并从中选择了1株菌TRM1-10进行后续实验。
为了验证TRM1-10是否参与植物抗病过程，作者首先将这种菌与青枯菌进行共培养，结果发现，TRM1-10并不能对青枯菌的生长产生抑制作用，但是将这种菌添加至植物根系后，植物对青枯菌的抗病性增强，并且受浓度的影响，当添加浓度为2*10^8时，才能明显的提高植物抗病性，至于是否再增加添加量会进一步增强抗病性，作者没有提到。另一方面，作者在不同的土壤，添加不同的菌进行对比后，都能发现TRM1-10能够缓解植株的疾病症状。由此可以得出结论，在抗病品种中富集的黄杆菌能够提高番茄抗青枯病的能力。
为了深入挖掘TRM1-10缓解植物发病的机制，作者分析了实验体系中随着时间增加，TRM1-10和青枯菌的丰度变化。同样是盆栽体系，作者分别收取了0天、7d、10d和14d的根系微生物组样品，在植物生长至7d时接种了青枯菌。采用了2种计数方式，qPCR和涂板计数，虽然qPCR得到的数量比涂板数量多，但两种方式得到的趋势基本一致。首先，在只接种TRM1-10的体系中，抗病品种7996在根际富集的TRM1的数量明显高于易感品种moneymaker，这与16S测序数据相一致，但通过对土壤中TRM1的数量进行分析后发现，在抗病品种的土中，TRM1-10的数量变化不大，但易感品种的土中丰度下降明显，推测很有可能抗病品种更易招募这类菌在其根际定殖。另一方面，对于易感品种来说，接种病原菌后TRM1-10的数量也有一定的提高，但是，不论是否添加TRM1-10，病原菌在易感品种的根际数量没有太大的变化。这部分数据虽然能够看出在整个过程中，TRM1和青枯菌的丰度会受到一定的影响，但并不能得到类似TRM1丰度升高导致病原菌丰度下降从而缓解植物疾病症状的结论，所以还需要更多的数据去发掘TRM1帮助植物抗病的机制。
那么，采用3步法对文章进行一下总结，首先，作者通过16S和宏基因组测序的方法对抗病品种7996和易感品种moneymaker的根际微生物组进行分析，发现两个品种的根际微生物存在差异，而且在不同实验体系中，抗病品种7996能够富集黄杆菌。由此，作者找到了差异菌。接着第二步，作者首先通过根际微生物互换实验，验证了抗病品种的土壤能够缓解易感品种的疾病症状，在验证根系分泌物对病原菌没有抑制作用后，作者分离的黄杆菌也没有发现能够帮助植物抗病。所以，作者进一步分析了宏基因组数据，重新拼接组装了一个新的黄杆菌TRG1的基因组，发现这种菌在抗病品种中丰度较高，同时对基因组信息挖掘，采用特殊的培养基有针对性的培养了包含TRG1基因组的黄杆菌TRM1。由此，作者获得了可能具有抗病功能的差异菌。最后，通过验证发现TRM1中的一株菌确实能够缓解易感植物的疾病症状。由此回答了文章中提出的科学问题，根际微生物确实参与了植物的抗病过程，抗病植株根系存在益生菌帮助植物抵抗病原菌。
在此基础上，作者进行了更加深入全面的讨论，同时指出了实验设计的一些不足之处。首先，作者认为用于分析两个品种的塑料大棚实验和温室实验室都没有进行重复，是否可重复无法证明，但在两个不同的培养环境下仍得到了相一致的结果，还是能够得到两个品种的根际微生物有差异的结论。另一方面，作者认为土壤对根系微生物的影响很大，实验中只采用了一种土，不能保证另一批土能得到相同的结论。所以，这两个方面是我们设计实验时一般要考虑的重复性和普遍性问题。除此之外，作者对下一步的研究也有一些展望，比如寻找调控益生菌的基因。另一方面，对于TRM1帮助抗病的机制需要进一步挖掘，之前说到青枯菌最主要的致病因子是胞外多糖，而TRM1的基因组信息显示它具有利用糖类的基因，很可能是TRM1与病原菌竞争了合成糖类的物质，减少了病原菌合成胞外多糖，由此缓解疾病症状，但这个猜想还需要实验验证。作者实验中也只用了一种黄杆菌，接下来还可以对其它菌进行验证，获得更多的益生菌，有可能对田间番茄青枯病的防治具有指导作用。
以上是我的报告内容，谢谢大家~
参考文献
Kwak, M.-J., H. G. Kong, K. Choi, S.-K. Kwon, J. Y. Song, J. Lee, P. A. Lee, S. Y. Choi, M. Seo, H. J. Lee, E. J. Jung, H. Park, N. Roy, H. Kim, M. M. Lee, E. M. Rubin, S.-W. Lee and J. F. Kim (2018). “Rhizosphere microbiome structure alters to enable wilt resistance in tomato.” Nature Biotechnology 36: 1100.
https://www.nature.com/articles/nbt.4232
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