Cell ：根部微生物跨界的互作促进拟南芥生存
The following article is from 植物微生物组 Author Wenzday
根部微生物跨界互作促进拟南芥存活
Microbial Interkingdom Interactions in Roots Promote Arabidopsis Survival
Cell, [31.398], Article, 2018-11-01
DOI: http://dx.doi.org/10.1038/s41592-018-0187-8
第一作者:Paloma Durán, Thorsten Thiergart
通讯作者:Paul Schulze-Lefert schlef@mpipz.mpg.de; Stéphane Hacquard hacquard@mpipz.mpg.de
主要单位：德国科隆，马普育种所；CEPLAS
其它作者：Ruben Garrido-Oter,Matthew Agler,Eric Kemen
In Brief: An interkingdom analysis of the microbes associated with Arabidopsis roots explains their functional contributions to plant survival.
拟南芥根部微生物跨界分析，解析了它们在植物生存中的功能
本文亮点
健康植物的根部由多界的微生物群落组成
细菌的根共生体(BRCs)形成真菌和卵壁的群落结构
BRCSs保护植物免受真菌和卵菌的侵害
BRCs的生物防治活性是一个功能冗余的性状，是植物生存所必需的
热心肠导读
Cell：细菌“好朋友”帮助植物抵御真菌危害
1-09 热心肠日报
原标题：根系微生物的跨界互作促进拟南芥存活
① 健康的植物根系同时定殖着细菌、真菌和卵菌，这些微生物如何相互作用以及对植物健康的影响尚不清楚；
② 扩增子测序检测了拟南芥根际微生物群落，网络分析发现了细菌和丝状真核微生物呈负相关；
③ 无菌的拟南芥重组实验发现细菌与真菌、卵菌互作有利于拟南芥生存，细菌在塑造真菌和卵菌群落结构时起重要作用；
④ 细菌对植物的保护作用具有冗余性，多个进化分枝的细菌都有助于植物抵抗真菌，表明健康的植物生长需要跨界的微生物群落平衡。
概述
健康植物的根部居住着土壤中的细菌、真菌和卵菌，它们隶属于不同的微生物界、独立进化。这些微生物是如何相互作用的，这些相互作用在多大程度上影响了植物的健康呢？人们对此还知之甚少。我们研究了三类拟南芥根部的微生物群落，并检测到细菌与丝状真核微生物之间大多呈负相关。我们建立了用于无菌拟南芥重组实验的微生物培养菌种库。在接种单一或混合的成微生物群落的植物上，观察到细菌根部微生物群落对真菌和卵菌的群落结构和多样性有深远影响。我们证明，细菌微生物对植物的生存和对根部丝状真核微生物的防御是必不可少的。对2862种细菌与真菌的原位交互作用进行去卷积，并结合植物群落扰动实验，结果表明细菌根部的生物防治活性是具有冗余性，可以保持微生物界间的平衡以保障植物健康。
引言
类似于脊椎动物的肠道，土壤生长的植物的根部居住着具有一定分类结构的细菌群落，它们各自为宿主提供健康益处。植物根可能具有的一个独特特征使它们作为宿主同时容纳的能力，除细菌微生物群外，还有一系列土壤中的丝状真核微生物，如真菌和卵菌，它们在不同的微生物界中独立进化。微生物-微生物的动态相互作用最近已成为叶际的一个重要特征，现在已承认这种相互作用对植物健康具有重要作用，包括对植物生长的协同作用，防止微生物病原体的侵害以及促进菌根共生。然而，原核生物和真核微生物沿着土壤根系连续体之间的相互作用以及跨界的微生物-微生物相互作用对于构建与根相关的微生物群落的相关性迄今为止很少受到关注。通过在天然拟南芥种群的根中分析三个微生物群（细菌、真菌、卵菌）并建立用于微生物群重组实验的参考微生物培养菌种库，我们提供了群落水平的证据，证明原核和真核根微生物群成员之间的负相互作用对于植物宿主存活和维持宿主-微生物群平衡是很重要的。
结果
根相关微生物组合
我们从德国两个邻近地区(Geyen和Pulheim；相隔5公里)以及较远的法国拟南芥自然群体中收集样本(图S1A)。对每个种群取四个重复，每一个重复样本由四个聚在一起的拟南芥个体组成，同时也对每个群体相应的土壤样品取样。根样品被划分为根外表和根内，分别富集根部表面或根内的微生物(图S1B)。我们通过细菌16S rRNA基因和真菌以及卵菌内部转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)区域的DNA扩增子同时测序，对土壤-根连续体中的多个界内的微生物聚生体进行了分类鉴定。α多样性指数(样本内多样性)表明从土壤到根内部的微生物多样性逐渐降低(Kruskal-Wallis检验，p值小于0.01)(图S1C)。测量不同样品的纲水平的微生物丰度(图1A)，使用线性模型对土壤、根表、根内样品OTU(operational taxonomic unit)富集检验，确定了96个细菌OTU、24个真菌OTU和1个卵菌OTU在所有三个取样点的拟南芥根部中始终富集(图1B)。这与简化的α多样性一起，指出了对于三个微生物界中的每一种微生物，根表对于其进入根内部都有门控作用。根富集的OTU属于细菌纲的有伽马变形菌纲Gammaproteobacteria(34%)、放线菌(26%)，贝塔变形菌Betaproteobacteria(24%)；真菌界的锤舌菌纲Leotiomycetes(40%)和粪壳菌纲Sordariomycetes(21%);和卵菌属Pythium。通过检查样本间变异(β多样性，Bray-Curtis距离)，我们发现细菌群落根据根部不同部位沿第一主坐标轴(PCoA)轴分布，而解释真菌和卵菌群落距离差异的主要因素是宿主的地理位置。微生物共现网络分析(图S1D和S1E)和置换多元方差分析(PERMANOVA检验; STAR方法)证实了根部位和取样点在细菌(部位：41%，p<0.001;取样点：19%，p<0.001)，真菌(部位：21%，p<0.001;取样点：43%，p<0.001)和卵菌(部位：14%，p <0.001;取样点：37%，p<0.004)群落结构中的对立效应。虽然用于鉴定微生物界群落组成标记基因的分化速率不同可能会夸大与根相关的原核和真核微生物群落之间的显著差异。我们的研究结果表明，地理上遥远的拟南芥种群具有分类学上相似的根相关细菌群落，但是在卵菌和真菌的组成则远远不同，且往往具有取样点特异的真菌和卵菌组合。
图1 三个拟南芥群体的微生物群落结构
（A）三个取样点（Pulheim、Geyen、Saint-Die）土壤、根外表、根内表中的细菌、真菌、卵菌的相对丰度。物种分类基于RDP数据库，采用bootstrap阈值0.5。所有样品中平均丰度小于0.5%的类归为低丰度并标为黑色。每个技术重复包括4株植物的混合。
（B）不同地点和取样部分部位显著富集的OTU相对丰度。采用广义线性模型用来比较某一样本的OTU与另外两个样本的OTU比较，p<0.05并使用FDR校正。OTU的相对丰度整合到纲水平。
（C）36个样品的主成分分析细菌、真菌、卵菌的群落结构。
根据Bray-Curtis距离画主成分分析的前两轴。用颜色差异取表示取样点，用不同的符号表示取样部位。见附图1，附表1、2
图S1 天然拟南芥群体的微生物群落简要介绍
（A）三个拟南芥群体的发育阶段和种植位点。这个位点包括两个地理上较近的群体Geyen、Pulheim（德国）以及较远距离的Saint-Die（法国）。所有群体在2014年春天开花期取样。
（B）分离方法。对于每个生物学重复(n=4)，每四个单株从种植的土壤中刨出来，样品被分成了土壤、根外表、根内表。
（C）不同取样点和部位的样品的α多样性。Shannon指数柱状图（上）、Chao指数柱状图（中）和观察到的OTU数目（下）。对于每三个指数，将所有位点的样品纳入考虑（稀释到1000个reads）。每个箱线图内的单个数据点对应三个取样点的样本（圆代表Geyen,三角形代表Pulheim，方块代表Saint-Die´）。ns, 非显著。 = p < 0.01, = p < 0.001, = p < 0.0001，（Kruskal-Wallis test）
（D）不同地点和隔间的微生物共现网络。网络显示单个微生物群体在不同隔间和位点的微生物OTU共现模式。基于Spearman相关性的网络。仅显示相关分数>0.6的边缘（p<0.05，Bonferroni校正）。对于每个微生物OTU，按取样隔间（上部）和地点（下部）分别着色。
（E）每个微生物网络的节点混合。对于每个微生物网络（左边：细菌，中部：真菌，右边：卵菌）。混合的节点数量根据每个OTU的隔间和地点附属关系进行画图。
根部微生物跨界联通
为了研究界间和界内部微生物OTU之间的关系，我们使用网络推理工具SparCC对上述三个取样点的群落描述数据进行隔间特异的网络分析(图2和S2A–S2E)。为了降低取样点特异的OTU对网络结构的影响，我们选择了核心微生物OTU进行分析，这些OTU在所有三个地点的Bulk soil，根外表、根内表80%的样本中都具有，且相对丰度(Relative abundances,RAs)>0.1%。与α多样性指数一致，微生物网络复杂性从土壤到根内表逐渐降低(土壤/根外表/根内表，731/454/178 OTUs以及42,043/8,518/1,125边，图2A和S2A)。值得注意的是，对根网络结构(根内表样本)的检查表明细菌和真菌之间的OTU主要呈负相关(92.0%)，而细菌(87.7%)和真菌(89.7%)组内的OTU主要呈正相关(图2A和2B)。大多数用SparCC方法鉴定的正相关和负相关的OTU同时通过Spearman相关性的验证(图S2F-S2I)。为了检验相关网络中潜在的进化信号，我们计算了包含至少5个OTU的分类群的细菌-真菌相关性的强度(图2C)。这表明属于β变形菌纲(Betaproteobacteria)，分歧杆菌(Bacilli)和德尔塔变形杆菌(Deltaproteobacteria)类的细菌OTU，以及属于座囊菌亚纲(Dothideomycetes)，锤舌菌纲(Leotiomycetes)和银耳纲(Tremellomycetes)类的真菌OTU，分别与细菌和真菌OTU最强负相关。进一步检查显示最高中介中心性分数和最高负跨界连接频率的真菌和细菌OTU，确定了5种属于真菌属Davidiella和链格孢菌(Alternaria)以及贪噬菌(Variovorax)，动单孢菌属(Kineosporia)和食酸菌属(Acidovorax)的OTU可能代表驱动拟南芥根中的真菌-细菌平衡的基石分类群(图2D)。总的来说，我们的网络分析表明植物根部的几种细菌和真菌分类群之间存在强烈的负相关。
图2 拟南芥根际内表微生物群的网络
（A）自然群体中拟南芥根表的根相关的微生物OTU相关性网络。每个节点代表一个OTU,每个节点之间的边对应由OTU的丰度推断的正相关（黑色）或者负相关（红色）（p < 0.05, correlation values < -0.6 or > 0.6）。属于不同微生物界的OTU具有不同的颜色，并且节点大小反映它们在根内表中的相对丰度。用虚线表示界内部相关性，用实线表示界间相关性
(B)根内表网络中呈现正相关（黑色）和负相关（红色）相关性的边的比例。B，细菌；F真菌；O：卵菌。
(C)在细菌和真菌OTU之间的微生物网络中测量的累积相关性得分。
细菌（左）和真菌（右）OTU按纲水平分组（每个纲多于5个OTU），并根据它们与真菌和细菌OTU的累积相关性分数进行排序。负相关细菌和真菌OTU的枢纽特性。对于每个真菌和细菌OTU，负的跨界连接的频率根据所有负BF连接推断的中介中心性绘制（其中节点位于所有其他节点对之间的最短路径上的情况）。五个微生物OTU表现出高频率的负连接和中介中心性得分代表“拮抗”的网络的中心，并用数字突出显示：（1）Davidiella，（2）Variovorax，（3）Kineosporia，（4）Acidovorax，和（5）Alternaria
图S2 土壤和拟南芥根外表面的微生物网络，与图2相关
（A）在三个天然拟南芥种群（Pulheim，Geyen，Saint-Die’）中检测到的基于相关性的根外表微生物（左）和土壤相关（右）OTU的网络。 每个节点对应于微生物OTU，节点之间的边缘对应于使用SparCC方法从OTU丰度曲线推断出的正（黑色）或负（红色）相关性(pseudo p-value > 0.05, correlation values < -0.6 or > 0.6)。属于不同微生物界的OTU具有不同的颜色编码，并且节点尺寸反映了它们在叶外表面隔室中的相对丰度。界内的相互关系用虚线表示，而届之间的相互关系用实线表示。
(B)在叶外表（左）和土壤（右）网络中负相关的细菌和真菌OTU的中心属性。对于每个真菌和细菌OTU，负相互连接的频率相对于从所有负BF连接推断的中介中心性绘制（其中节点位于所有其他节点对之间的最短路径上的情况）。
(C)边缘的比例在根外白表面微生物（左）和土壤（右）网络中显示正（黑色）或负（红色）相关性。B：细菌，F：真菌，O：卵菌。
(D)在真菌和细菌OTU之间的根外表微生物（左）和土壤（右）网络中测量的累积相关性得分。 真菌OTU在纲级（> 每个纲多余5个OTU）进行分组，并根据其与细菌OTU的累积相关性分数进行排序。
(E)在细菌和真菌OTU之间的根外表面（左）和土壤（右）网络中测量的累积相关性得分。 细菌OTU按纲级别（> 5个OTU /类别）进行分组，并根据它们与真菌OTU的累积相关性分数进行排序。
（F-I）使用Spearman相关验证SparCC定义的（反）相关OTU
（F）在两个网络中的一个网络唯一，或由两个网络共享的边缘数量（B=细菌OTU之间的连接，F=真菌OTU之间的连接，BF=真菌和细菌OTU之间的连接，pos =正相关连接，neg = 负相关的连接）。
(G)Spearman相关推断的分类群之间的累积负相关。
(H)来自sparCC网络的十个最正相关的OTU以及基于OTU相对丰度推断的Spearman相关性
(I)来自sparCC网络的十个最负相关的OTU以及基于OTU相对丰度推断的Spearman相关性。
根源微生物培养物收集
为了测试跨界的微生物-微生物竞争是否与土壤根系连续体相关，我们首先通过分离培养与根相关的细菌、真菌和卵菌的微生物来解构拟南芥根的微生物群落。对于细菌，我们使用最近建立的拟南芥根源细菌培养库，其中54%-65%根富含的细菌OTU在纯培养基中具有一个或多个分离物。为了补充这一菌种库，我们从24个种植在（Cologne agricultural soil, CAS）处于三个发育阶段的拟南芥Col-0个体的根部进行了大规模的丝状真核微生物分离。此外，在Geyen，Pulheim和Saint-Die天然地点种植的2到6个植物个体用于分离根相关真菌和卵菌。总共将12,000个表面灭菌的根片段(每个5mm)置于五个基于琼脂的生长培养基上，从而纯化培养202个丝状真核生物。基于对真菌或卵菌的ITS的Sanger测序，使得分类学成功鉴定176个菌株，其中93%是真菌，7%是卵菌。在消除潜在的克隆重复序列(定义为从同一土壤中生长的植物根部回收的ITS 100%相似性的微生物)后，真菌培养库包含69个分离菌株，主要属于粪壳菌纲Sordariomycetes（65%），座囊菌纲Dothideomycetes（24%）类别的分离物，和伞菌纲Agaricomycetes（4%），而卵菌集合包含11个专门属于腐霉属（Pythium）的菌株（图S3A和S3B）。在鉴定天然拟南芥中的根相关真菌和卵菌群落的分类组成时，我们的培养依赖方法的结果类似于使用不依赖于培养的ITS扩增子测序的结果（图3A）。为了估计培养率，我们将基于Sanger的参考ITS序列与相应的不依赖培养的数据集（>0.1%RA）在序列相似度为97%水平进行了比较。通过考虑丰度较高的OTU，它们共同占所有根样品中检测到的序列读数总数的60%或80%，我们估计真菌的培养率分别为50％和37％，卵菌的回收率分别为50%和28%(图3B)。一些根源性丝状真核生物，例如芸薹油壶菌(Olpidium brassicae)对应于丰度较高的OTU8，可能因为其专性的活体营养型生存方式而难以分离（图3B）。我们的发现表明在自然群体中种植的拟南芥的根部相关的最丰富的丝状真菌能够被分离纯培养，这也为在实验室重新构建根部多界微生物菌群提供了机会。
图3.根源真菌和卵菌培养物集合的回收率和分类学表征
（A）培养依赖性和培养非依赖性方法之间的真菌（上图）和卵菌（下图）分类组成的比较。培养物收集：从CAS和三个天然位点Pulheim，Geyen和Saint-Die’中分离的植物根中分离的69种真菌和11种卵菌菌株的分类组成（类别水平）（图S3A和S3B）。不依赖于培养的方法：在用于培养的相同土壤中生长的拟南芥根中检测到的真菌和卵菌根相关OTU的分类组成（在至少一个位点上相对丰度 > 0.1%，RDP物种类别注释置信度阈值为0.8)用于与培养依赖的方法比较。
（B）在不同阈值下来自培养物收集物的真菌（上图）和卵菌（下图）分离物的回收率。等级丰度图显示了在上述土壤类型中生长的拟南芥中50个最丰富的与根相关的真菌和卵菌OTU以及它们的累积相对丰度。在培养物集合中具有代表性分离物的OTU（97%序列相似性）用黑色条突出显示。对于代表总读数的60%和80%的OTU，给出回收的纯培养物的天然存在的OTU的百分比。
图S3. 真菌和卵菌培养物的系统发育多样性和真菌对植物生长的影响
(A)对于显示不相同的ITS或源自不同位点的所有分离株，Sanger测序的真菌ITS序列的最大似然法进化树。 真菌分离株（Mor = Mortierella，Elm = Elmerina，Cop = Coprinopsis，Rhi = Rhizoctonia，Den = Dendryphion，Pho = Phoma，Pyr = Pyrenochaeta，Alt = Alternaria，Pha = Phaseolina，Par = Paraphoma，Mac = Macrophomina，Api = Apiosporina ，uL = Leotiomycete，Lep =unclassified Leptodontidium，Zal = Zalerion，Tru = Truncatella，Mic = Microdochium，Aso = Asordaria，Cha = Chaetomium，Ver = Verticillium，Ple = Plectosphaerella，Cyl = Cylindrocarpon，Sta = Stachybotrys，Fus = Fusarium， Ily = Ilyonectria，Neo = Neonectria）。 第一个外环表示每个分离物的起源，第二个环表示从同一位点分离的具有100%序列一致性的分离物的数目，因此代表克隆重复。 在重建实验中使用的分离物用红色方块突出显示。
(B)对于显示不相同的ITS或源自不同位点的所有分离株，Sanger测序的卵菌ITS序列的最大似然树。Oomycetal分离株（Phy = Phytium）。第一个外环表示每个分离物的起源，第二个环表示从同一位点分离的具有100％序列同一性的分离物的数目，因此代表克隆重复。用重建实验中使用的分离物用红色方块突出显示。
(C)单个真菌分离物对FlowPot系统中拟南芥生长的影响。 箱形图描绘了与多界微生物重建实验中使用的34种真菌菌株中的每一种孵育三周后拟南芥Col-0植株的标准化鲜重（参见图4）。对于每个箱图，至少有三个技术重复的三个生物重复（描绘为具有不同形状）。用星号表示显著差异（p<0.01，使用Dunn’s post hoc test Kruskal-Wallis)。缺乏细菌时富集的11种真菌菌株(图S4E中所示)以红色突出显示，缺少这11种真菌分离物的23个成员的真菌群落对植物生长仍然是有害的(富含真菌群落)。N.A.：数据缺失。
多界根部微生物重构
使用从拟南芥根部或者种植在CAS的近缘物种中唯一分离出来的微生物，我们组装了7个复杂的合成微生物群落，主要由148个细菌（标为B），34个真菌(标为F)以及8个卵菌（标为O）组成,以及对应的多界微生物聚生体组合（BO,BF,FO,BFO）。这些微生物，基于物种分类多样性进行选择，用于重新定殖在含有泥炭和蛭石的无菌FlowPot系统作为无菌土壤基质，在其上放置表面灭菌的拟南芥Columbia-0（Col-0）种子。在这些底物中共培养这些微生物群落和植物宿主4周后，在没有根共生细菌（F，O，FO）的情况下，丝状真核微生物对植物生长及其存活率具有强烈的不利影响（p<0.05，Kruskal-Wallis Dunn post hoc test ），而与细菌群落（BO，BF）相结合，植物生长恢复到与无微生物（MF）处理的对照植株一样的水平（图4A）。尽管观察到样品间的差异很大，但与MF植物相比，增加微生物聚生体（BFO）的复杂性显著的促进植物生长（植物生物量增加125%; p <0.05，Kruskal-Wallis with Dunn post hoc test），表明多界微生物菌群对植物生长的有益活性（图4A）。为了验证微生物的相互作用是否有助于植物健康表型，我们同时使用相同的测序策略分析了在自然位点中根中建立的细菌，真菌和卵菌群落（结合episphere和endosphere部位）和周围的Flow-Pot基质。与细菌限制真菌和卵菌在土壤-根连续体的生长的假设一致，细菌群落的存在显著降低了基质中这些微生物群落的α多样性（Kruskal-Wallis with Dunn’s post hoc test, p < 0.05)(图4B和S4A)。值得注意的是，在存在丝状真核微生物（B与BF，BO，BFO）的情况下，细菌群落的分类结构在基质和根室中基本保持不变，而在细菌存在下观察到明显的真菌和卵菌群落变化(F，FO与BF，BFO/O，FO与BO，BFO)。重要的是，细菌介导的真菌群落转变在很大程度上与植物无关，因为这种转变也见于未种植的基质（BFO UNPL）(图4C, S4B, and S4C)。置换多元方差分析（PERMANOVA）表明，真菌和卵菌群落结构的11.6％和7.8％的变异分别由细菌的存在来解释，而丝状真核生物的存在仅解释了细菌结构变异的2.20%至3.65%（P < 0.05）。使用线性模型进行的富集检验鉴定出11种真菌和4种卵菌分离物，在没有细菌的基质样品中相对丰度（RA）显著增加(图S4D和S4E)。对照样品的扩增子测序验证了无菌 FlowPot系统的无菌性，并显示接种后4周，在B，F和O处理之间没有交叉污染的基质样品(图S4F)。我们的研究结果表明，细菌介导的真菌和卵菌群落变化与植物生长恢复有关，并表明根部微生物细菌的主要生理功能是保护植物免受根源丝状真核生物的有害活动。
图4 拟南芥根系多界微生物重建
(A) 在FlowPot系统中，使用根源细菌(148)，真菌(34)和卵菌(8)分离株对无菌植物进行重新定殖。接种细菌(B)，真菌(F)的4周后拟南芥Col-0的鲜重;卵菌(O);细菌和卵菌(BO);细菌和真菌(BF);真菌和卵菌（FO）;和细菌、真菌和卵菌（BFO）。 MF，无微生物/对照。 将鲜重重量值与MF进行标准化。 用字母表示显著差异（p <0.05，Kruskal-Wallis Dunn post hoc）。 存活率值表示存活的发芽植物的百分比。数据来自三个生物学重复（由不同形状表示），每个具有三个技术重复。
(B) 对于每种上述接种基质样品中，观察微生物组物种数量（p <0.05，Kruskal Wallis with Dunn’s post hoc test）。 输入，初始微生物接种物; UNPL，未种植的基质。
(C) 4周后初始输入、输出的基质和根样品中的微生物分离物的相对丰度。在细菌的门水平和真菌和卵菌的物种水平显示了分类。 括号中的数字是指在B，BF或BFO条件下特异性富集基质样品的细菌，真菌和卵菌菌株;F，BF或BFO条件;或O，BO或BFO条件，如图S4E所示。
图S4. FlowPot系统中的多界微生物群重建实验，与图补充
（A）多界微生物群重建系统中基质和根区室中的微生物α多样性。 在FlowPot系统中用根来源细菌（148），真菌（34）和卵菌（8）分离物重新定殖无菌植物，并在四周后收获基质和根部位样品。 观察到基质（棕色）和根（绿色）样品中的细菌（左图），真菌（中图）和卵菌（右图）OTU数目，以及在T0（灰色）的FlowPot系统中接种的相应微生物输入群落（p<0.05，使用Dunn事后检验的Kruskal-Wallis）。由于相应处理中没有活植物，几个根样品的数据点缺失。B：细菌，F：真菌，O：卵菌，UNPL：未种植的盆。注意观察到的真菌和卵菌的OTU在存在细菌时显著减少。
（B）接种后四周FlowPot系统中基质和根区室中的微生物群落结构。PCoA分析细菌，真菌和卵菌的组成（从左到右）; 形状代表三种生物学重复，颜色代表不同的微生物组合。B：细菌，F：真菌，O：卵菌，UNPL：未种植的盆。
（C）基质（棕色）和根（绿色样品）到对照组（BB，FF和OO）的细菌，真菌和卵菌形态（从左到右）的样品组间的相对Bray-Curtis距离（如接近1时，与对照组更相似; 参见文章星标方法部分）。用不同的字母表示了显著的差异（Kruskal-Wallis与Dunn post hoc，<0.05）。
（D）共接种对微生物菌株富集的影响。在不同组合中共同接种细菌，真菌和卵菌菌株的成对富集试验（广义线性模型，p.adj.method = FDR，p值<0.05）（B：细菌，F：真菌，O：卵菌）。与另一种组合相比，一种组合中的富集菌株用红色块描绘（例如，与BF相比，Root762富含B）。
（E）三元图表示每种组合中的富集菌株（彩色圆圈）（广义线性模型，p.adj.method = FDR <0.05）与其他两种组合。 圆圈的大小表示每个菌株的相对丰度，并且每个边缘的紧密度表示在该给定条件下更高的流行率。
（F）在无微生物（MF），B，BFO，F和O基质样品中检测到的细菌，真菌或卵菌分离物的数量（以97%序列一致性为阈值的参考序列）。
（G）来自天然位点和合成群落的根相关微生物群落丰度的比较。左图：重建实验的合成群落（BFO）的根样本（参见图4）和来自天然位点（PU，GE，SD）的根样本或科隆农业土壤中生长的植物之间的Bray-Curtis距离（CAS，用于建立微生物培养物收集品）。 Kruskal-Wallis检验，ns=不显著，p<0.01，p<0.001，p<0.0001。右：使用上述根样品的主成分分析确定β多样性。仅考虑在三个自然位点和CAS样本中发现的100个最丰富的与根相关的OTU来计算样本之间的距离。）
细菌生物防治活性的多重性
为了阐明34个成员真菌群落对植物生长的不利影响是由一种或几种真菌菌株介导的，我们用单独的真菌分离株在无菌种植盒(gnotobiotic FlowPot)系统进行了重新定殖实验（图S3C）。这表明，从健康的拟南芥中分离出的多数（即18/34）根源真菌限制了宿主植物生长，而16/34真菌菌株对植物生长没有显著影响（p<0.01，Kruskal-Wallis Dunn post hoc test）。在我们的微生物重组实验中，只有一部分对植物生长有害的真菌菌株的丰度在细菌存在的情况下存在明显的降低（6/18），表明细菌类的根部共生物不能选择性的限制有害的根相关的真菌生长（基质样品，图S3C和S4E）。一致的是，一个包含23个成员的真菌菌落缺乏11个丰度被细菌负调节的真菌菌株，依然对植物的生长是有害的（图S3C）。
为了鉴定在我们的多界微生物群重建实验中可能有助于拯救植物生长的细菌分类群，我们开发了一种高通量的异位细菌真菌互作筛选(图5A和S5A-S5C)方法。简而言之，成孢的真菌菌株中收集的孢子被接种到含有液体胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)培养基(20%)的96孔板中，在根部共生细菌个体存在或者不存在条件下培养48小时。真菌的生长速率由几丁质结合实验的荧光确定（图S5A）。我们以三次重复检查了2862个双元互作，以106个上述的根部共生细菌和进化上多样的菌种库中的27个真菌互作组合，其中包括微生物重组实验中的7个真菌（图5A和表S5）。在检测到的拮抗互作中我们鉴定到了明确的系统发育信号，包括一些丛毛单胞菌科的细菌株系(Comamonadaceae)，假单胞菌的细菌株系(Pseudomonadaceae)，根瘤菌科(Rhizobiaceae)的细菌株系，黄杆菌科(Flavobacteriaceae)的细菌株系，表现出强的竞争潜力。因此，一些细菌类的根部微生物分类系可以针对广谱拟南芥根系的真菌发挥直接的抑制活性。大多数放线杆菌株系表现出针对检测的真菌单株相对弱的或者不显著的抑制活性。通过SparCC网络分析中鉴定的天然位点样品中的相关性强度与在高通量真菌-细菌相互作用筛选中确定的二元相互作用表型的比较揭示了大多数测试的细菌谱系的一致趋势并且鉴定了贪噬菌属(Variovorax)和食酸菌属(Acidovorax)菌株、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae科)作为有前景的生物防治微生物(图S5D-S5F)。这表明根共生的细菌直接抗真菌活性是影响自然界生长的植物根系多界微生物群落中细菌和真菌OTU之间大量负相关的重要决定因素。
我们推断，二元筛选中检测到的细菌介导的真菌生长抑制是否在群落环境中得到维持，那么从完整的148个成员的细菌群体去除最具有竞争力的属于假单胞菌科（-P，8个成员）和/或丛毛单胞菌科（-C，10个成员）的细菌，可能导致细菌介导的宿主保护活性的降低。我们在无菌的拟南芥上重新定殖了包含上述34个成员的真菌群落，在培养基中存在所有或者3个扰动的细菌群落（BF or BF-C, BF-P, BF-C-P）（图5B）。细菌的群落分析验证了-P和-CP样品中所有假单胞菌科菌株的消耗（去除与未去除的样品中假单胞菌相关reads数减少了99%）并且在10个丛毛单胞菌科分离株中有9个被去除-C和-CP样品（去除与非去除样品中丛毛单胞菌科相关读数减少59%)（图S5G-S51）。缺乏这两个科的细菌群落依然能保护植物在合成真菌群落中存在时的生存，但是与空白对照相比不能充分挽救植物的生长（BF versus BF-C-P, Kruskall Wallis with Dunn’s post hoc test, p < 0.05,图5B）。这些结果表明假单胞杆菌科和丛毛单胞菌科的根部共生细菌可能有助于观测到的植物生长挽救，也指示出来自其他分类学谱系的菌株有助于在没有这些科的菌株成员的情况下保护拟南芥。为了阐明属于假单胞菌和丛毛共生菌的细菌菌株对宿主的保护作用，我们接着单独的量化每个菌株的保护活力。一些属于贪噬菌属(Variovorax,3/3）、假单胞菌属(Pseudomonas,4/6)、嗜糖假单胞菌属(Pelomonas,1/1)、嗜根杆菌属(Rhizobacter,2/4)的单个菌株的存在，但是没有食酸菌属(0/4)，能够充分的完全或者部分挽34个真菌群落中的成员介导的植物生长抑制（图5C）。总之，利用天然取样点采集的样本基于网络的方法预测根系微生物群跨界连通性、二元真菌-细菌互作实验和无菌植物的群落扰动实验表明，细菌根微生物群赋予的保护活性是由几种细菌谱系介导的多重性状。
图5.细菌根微生物群落对根关联真菌的抑制活性
（A）与系统发育上不同的根共生细菌相互作用后真菌生长的改变。 热图描绘了使用具有小麦胚芽凝集素（WGA），Alexa Fluor 488配合物的几丁质结合测定法通过荧光测量的真菌相对生长指数log2（存在与不存在细菌竞争物）。基于完整的细菌16S rRNA基因序列构建系统发育树，并且用黑色圆圈描绘支持率。垂直和水平条形图分别表示每种细菌菌株的累积拮抗活性和每种真菌分离物的累积敏感性得分。交替的白色和黑色用于区分细菌家族。所有细菌和7/27真菌（以粗体突出显示）用于上述多界重建实验（见图4）
（B）相对于不含微生物的对照植物，仅用真菌（F）或细菌加真菌（BF，BF-C，BF-P，BF-C-P）接种后植物的鲜重。 -C，撤除丛毛单胞菌科菌株; -P，撤除假单胞菌科菌株。用字母代表显著的差异（Kruskal-Wallis与Dunn post hoc tets，p <0.05）。 对于每种菌株，指示仅接种细菌的对照植物的相对鲜重（蓝色垂直线;标准误差，n=8）。虚线灰色水平线表示不含微生物的植物的鲜重，标准化为1。
（C）与（B）中的实验相同，但不是去除细菌菌株，而是将单个细菌分离物与34个成员的真菌群落（F）共同接种以确定它们对植物生长拯救的能力。
图S5. 高通量真菌-细菌互作筛选和细菌根共生的生物防治活性(图5补充)
（A）实验方案的示意图。 将真菌孢子均匀地分配到透明底96孔板的孔中，并在液体培养基（筛选板）中存在或不存在不同的根源细菌（固定相）下孵育。在不存在真菌孢子的情况下也培养细菌作为对照（背景板）。在相互作用48小时后，使用三个洗涤步骤来消除悬浮液中的细菌细胞。请注意，真菌菌丝体粘在板的透明光学底部。在小麦胚凝集素中孵育过夜并再进行两次洗涤后，使用酶标仪测量荧光强度(反映真菌生长)。如图所示计算相对生长指数。
（B）在最小培养基（M9）和富含碳的培养基（20% TSB）中与根菌群的不同系统发育成员竞争时，Plectosphaerella cucumerina分离物10的生长改变。基于完整的细菌16S rRNA基因序列构建系统发生树，并用黑色圆圈描绘支持率。热图描绘了通过荧光测量的log2真菌相对生长指数（存在与不在细菌竞争物）（参见上文）。 注意在最小和复杂介质中有类似的整体抑制活性。
（C）相关性验证实验，其中针对10个随机选择的真菌重新筛选细菌菌株。将荧光强度（log2）与从第一生物学重复获得的荧光强度（log2）进行比较。
（D）网络衍生的相关性和实验验证的细菌科与真菌物种的相互作用的比较。对于拮抗筛选和根相关OTU网络分析之间共有的每个细菌纲，表示针对真菌分离物的平均拮抗活性和与网络中真菌OTU的累积相关性。考虑了具有两个以上成员的细菌纲，并且将两个测量的值标准化为在相同范围内。
（E）直接比较来自根网络的细菌OTU与用于拮抗筛选的细菌分离菌株。每个数据点对应于细菌OTU-分离菌株对（> 97%序列相似性; 仅显示最佳匹配）。对于每对匹配，将来自真菌OTU（来自细菌OTU）的网络衍生的相关性与拮抗筛选（来自细菌分离物）的结果作图。
（F）与E）相同，但数据以相关散点图展示。
（G）在FlowPot微生物群重建系统中验证一部分细菌菌株的去除效应。接种后4周的输出基质和根样品中假单胞菌科（上部）和鞘翅目科（下部）科的分离物的相对丰度（直接作图100%序列相似性）。RA：相对丰度。-C：10个丛毛单胞菌科菌株的去除，-P：8个假单胞菌科菌株的去除。-C-P去除18个Comamonadaceae加Pseudomonadaceae菌株。对照样品接种完整的148个成员的细菌群落。 注意，一个食酸菌属（Acidovorax）菌株（Acidovorax 275）无意中没有从-C去除的样品中除去。该Acidovorax菌株在真菌群落存在下不能拯救植物生长。
（H和I）针对所有条件呈现（H）真菌分离物和（I）细菌分离物（100%序列相似性的直接作图）的相对丰度。B：完整的148个细菌群落。 F：34个成员真菌群落。-C：丛毛单胞菌科培养株去除。-P：假单胞菌培养株去除。-C-P：丛毛单胞菌科培养株和假单胞菌培养株株都去除。
讨论
细菌、真菌、卵菌分别在35、10.5、5亿万年前起源，可能在植物在陆地栖息地定居之前大约4.5亿万年前的土壤中就共存、互作。这些微生物群体之间可能存在土壤有机质竞争，包括根分泌的光合作用产物，可以解释我们的发现，正相关在每个微生物界内部占主导地位，而负相关在细菌和丝状真核生物界间占主导地位。虽然我们的根源微生物菌种库中仍然缺乏一些丰度较高的微生物群成员，但在无菌拟南芥植物的根中建立的CAS衍生的合成细菌和真菌群落的组成比其他受检测的自然取样点更接近于相应的CAS中生长的植物根系微生物(S4F)。这表明在我们的无菌植物系统中，与根相关的细菌对真菌和卵菌群落结构（分别解释>7％和>10％的方差）的显著影响，部分地概括了有助于植物生存的自然环境中的微生物相互作用。鉴于拟南芥根系相关的真菌和卵菌群落展示出很强的生物地理信号，也可能受其扩散限制和/或气候的影响，我们提出，根共生的细菌对系统发育不紧密相关的真菌的生物防治活力有助于强力的植物保护。属于贪噬菌属和假单胞菌属的的细菌分离物赋予宿主的强力保护作用，是根核心微生物群的成员，并且占三个天然位点的拟南芥根中检测到的16S rRNA读数的24%。我们观察到根系不同分类谱系的单个细菌菌株足以保护植物宿主免受分类学上多样化的根系定殖真菌的影响，这至少为解释农田中使用的一部分生物防治细菌的活性提供了一个合理的框架。
在没有植物的情况下观察到的细菌介导的真菌和卵菌群落的变化暗示宿主衍生的物质对于拮抗性不是必要的（图5C）。鉴于所有测试的微生物都是从植物根部分离出来的，在基质中检测到的根相关微生物之间竞争可能反映了植物根系中微生物界之间发生的竞争。这可能解释了为什么在微生物群重建系统中接种细菌会对基质和根样本中真菌和卵菌群落有类似的改变（图4C）。缺乏来源于未种植的土壤整体微生物培养物不允许我们检测根部细菌微生物群是否是从一小部分土壤生物中细菌水平获得的, 还是在能够限制丝状真菌在根部定殖的细菌中是富集的。然而，这一假说得到我们基于网络的微生物界间互作分析的间接支持，其中真核生物和丝状真菌间的负相关和正相关的比率从土壤网络中的4：1转变到根内生植物网络的12:1(图2B和图S2C)。总之，这些结果表明，检测到的微生物界间的相互作用在发生于微生物建立时期的土壤-根部面发生并且在植物根内部维持。
鉴于我们的研究中所使用的所有细菌、真菌、卵菌株系都是从健康的拟南芥根部植株中分离出来的，包含细菌和丝状真核生物的合成群落对植物健康的对比效果令人惊讶。拟南芥或亲属中菌根共生的丧失似乎能够被部分根内生的有益真菌补偿。我们的数据显示，天然种植的拟南芥根部拥有丰富多样的丝状真核生物，以子囊菌为主，但也表明在没有细菌竞争者的情况下，丝状根源真核生物（F，O，FO）的聚集体 主要呈现对植物健康和生存有害的活性。引人注目的是，>50%的真菌分离株与植物宿主的单一结合时限制植物生长。这与早期的报道一致，也表明了许多拟南芥根相关的真菌和卵菌不仅能依靠植物先天免疫系统免疫。然而，用最复杂的多界微生物聚生体（BFO）重新定殖拟南芥，在我们的无菌植物系统中导致最大植物生长速率和存活率。因此，我们提出，作用于植物宿主及其相关微生物群的相互选择压力，在进化时间尺度上，有利于微生物-微生物界之间的互作，而不是与单一微生物纲相关联。
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