Science新闻：肠道菌群又添一大功能，揭示你的真实年龄
肠道菌群又添一大功能，揭示你的真实年龄
撰文：陈亮 中科院微生物所
责编：刘永鑫
写在前面
日前从热心肠日报看到，Science杂志发了一则新闻：肠道里的细菌可能会揭示你的真实年龄，感觉非常有趣，遂下载原文仔细阅读一番。此文于2018年12月28日，发表于著名的预印本杂志bioRxiv上，Science杂志于2019年1月11日就对其进行了报道，并给出了高度评价，可见此研究的重要意义非同一般。
众所周知，目前最火的研究领域，莫过于肠道菌群和深度学习，而此项研究的作者，完美的将这两项研究结合，为我们带来一项非常有趣的研究。该研究通过深度学习的算法分析肠道菌群组成来预测人体年龄，误差在4岁以内，说明菌群或许可作为标志物用于衰老相关的研究。
以下为对文章的研究思路与研究结果解读：
先来一张整体思路图，作者的主要思路就是利用深度神经网络的方法，从健康人的肠道菌群里寻找可以预测年龄的细菌物种。
Figure 0
热心肠日报
https://www.mr-gut.cn/papers/read/1099651870
Science新闻：肠道菌群，你的微生物“生命之钟”
创作：栾晓东 审核：李丹宜 01月15日
原标题：肠道里的细菌可能会揭示你的真实年龄
研究者使用机器学习分析了1165名健康人的3600多个肠道菌群样本，初步锁定了90%样本中均含有的95种细菌；
其中有39种细菌与年龄预测明显相关，算法预测的年龄可精准到4岁以内；
随年龄增加，霍氏真杆菌等变得丰富，而与溃疡性结肠炎相关的普通拟杆菌会减少；
“菌群老化时钟”不仅能预测人体年龄和衰老速度，也可用于研究饮食、抗生素等物质对人体衰老和健康的影响；
这种菌群时钟特征的普遍性，以及其与衰老的因果关系，仍需深入研究。
主编评语：Science上周发表的新闻对bioRxiv上一项预印版的研究进行了报道( https://www.biorxiv.org/content/early/2018/12/28/507780 )，该研究用机器学习算法可通过分析肠道菌群组成来预测人体年龄，误差在4岁以内，说明菌群或许可作为标志物用于衰老相关研究。虽然因果性仍待更多研究阐明，但肠道菌群与衰老之间存在密切关联已无法否认。
摘要
人体肠道微生物组是一个复杂的生态系统，它既影响宿主的生存状态，又受宿主生存状态的影响。前人对肠道微生物组的分析揭示了特定微生物与宿主健康和疾病状态、基因型和饮食之间的关系。在本研究中，基于一个包含1165个健康个体(3663个微生物组样本)的数据集，作者开发了一种基于肠道微生物组来预测宿主生理年龄的方法。此预测模型，可以称之为“人体微生物组时钟”，基于深度神经网络方法，交叉验证的平均绝对误差达到3.94年。“人体微生物组时钟”的预测性能也在其他几个群体数据中得到了验证。此外，作者还开发一个基于重排特征重要性和累积局部效应，对年龄模型中单个微生物特征进行生物学解释的平台。通过此方法，作者得到了两份包含95种与人类年龄相关的肠道生物标志物的清单。进一步研究表明，这个清单可以精简到39个与宿主年龄最想关的细菌物种。整体结果表明：
(a)微生物特征可以用来预测人类年龄;
(b)模型选择的微生物特征与年龄有关。
背景
人类的肠道被数以亿计的微生物所覆盖， 大约包含10^14个细胞， 大大高于宿主细胞的数量。肠道微生物组是一个复杂的生态系统， 具有多种重要功能的有机体。除了作为消化系统的核心部分，微生物还可以调节免疫，控制外源性物质，产生重要的代谢产物，甚至影响神经功能。然而，微生物组影响宿主的特性仅仅是这其中的一面，它们还可以通过信号反馈循环对宿主的信号作出响应。例如，多项研究表明，肠易激综合症（IBD）表现为肠道感染后产生强烈的免疫反应。微生物组对促炎环境的反应是有益菌的数量减少，在这种不利条件下，这些有益菌缺乏生存的能力。反过来，宿主免疫系统会抑制导致产生慢性炎症的致病菌的繁衍。这些变化在每个人的生命中不断发生，可能对我们有害，也可能对我们有益，可以反映出个人选择或更广泛的跨人群影响因素。
宏基因组研究为我们了解肠道微生物如何随着年龄的发展加深了认识。研究发现，肠道定殖主要是发生在出生时与产道细菌的接触。“先锋微生物”主要由兼性需氧菌(如Escherichia， Enterococcus等)构成，并在母乳喂养阶段逐渐被专性厌氧菌(如Bifidobacterium infantis)取代。断奶后，肠道微生物的群落逐渐变得与成人微生物相似。微生物的这些早期定殖阶段是极其重要的，因为正常的婴儿肠道菌群可以促进肠道粘液形成，防止病原体繁殖，调节免疫T细胞。具有非正常的肠道菌群(例如Clostridium和Escherichia属的细菌大量增加)的婴儿更容易患湿疹和食物过敏，这进一步说明肠道菌群早期定殖的重要性。许多因素，如出生方式(顺产或剖腹产)，婴儿饮食(母乳或配方奶粉)和产妇微生物组组成都大大影响婴儿肠道微生物组的发展。
尽管关于婴儿肠道菌群演替研究很多，并且可用于评估各种健康问题的风险。但是成人肠道微生物的演替研究却很少。此外，由于地理位置，病史，饮食，和其他因素的影响，分析成人肠道微生物的演替成比婴儿要困难许多。与年龄相关的人体微生物组研究未能得出肠道菌群衰老的直接理论。一些研究表明，在老年人肠道中生物多样性减少。但是另一些研究则表明老年人肠道中具有和年轻人同样的微生物多样性。有些研究发现在衰老过程中某些特定微生物群系的变化。例如，在老年人中Bacteroides， Bifidobacterium， Blautia， Lactobacilli， Ruminococcus减少，而Clostridium， Escherichia， Streptococci， Enterobacteria增加。然而，由于方法学不同、数据不平衡等问题导致这些发现在不同的研究中差异很大。
在老年人肠道中，通常产短链脂肪酸(short-chain fatty acid, SCFA)的细菌Roseburia和Faecalibacterium会减少，而耐氧菌和致病菌会增加。这些变化会导致失调，进而引起多种老年性疾病的发生。肠道微生物组可能影响衰老的的想法并不新鲜，早在20世纪初，俄罗斯科学家、诺贝尔奖获得者Ilya Metchnikoff就提出有害微生物处理未消化的食物(特别是导致食物腐败的细菌，如Escherichia和Clostridium)可以导致自身中毒。用前处理或者后处理的生物制剂（如乳酸菌制剂)治疗自身中毒，可以有效缓解与年龄有关的身体机能的下降。最近的研究表明，这一具有百年历史的假设很可能是正确的。
目前，想要将肠道微生物组明确分为三个时间状态（幼年，成年和老年）的标准方法还缺少明确的规则。其中，成人微生物组仍然是最大的谜团。它没有确定的继承阶段，如新生儿，也不像老年人那样有明显的梯度变化过程。这就提出了一个问题:正常的成年微生物组究竟是在发育，还是处于停滞状态?考虑到老化过程是渐进的，包括损伤的积累和其他有害变化，假设肠道微生物群落的演替是渐进的似乎很合乎逻辑。然而，想使用微生物组驱动的特性来预测实际年龄有很大的不确定性。采用支持向量机模型将人类宏基因组样本归为年轻或老年，准确率只比随机归类高10-15%。另一项研究试图使用聚类方法，将0-100岁的宿主归类，但是某些特定的类群在年轻和中年人群中变化极大。然而，由于缺乏饮食和生活方式方面的数据，作者无法对肠道菌群的发展形成一个有效的结论。与平均绝对误差(MAE)小于5岁的DNAm年龄预测时钟（DNAm aging clocks）相比，这些方法预测年龄的能力还有很大的改进空间。
深度学习(Deep learning, DL)方法的复兴从2015年开始，主要应用为图像，声音，文字识别，以及一系列的生物医学应用程序，如药物再利用和目标识别。其中一个最重要的例子就是深度学习在生物医学中关于从头分子设计中的应用。在衰老研究的背景下，这些新方法可以结合起来进行老年保护器（geroprotector）的开发。事实上，自2013年以来，基于人类和其他生物模型已研制出许多衰老时钟。已经发表的利用深度学习方法的衰老时钟主要依靠临床血液检测，面部图像，身体活动数据和转录组数据。这些时钟通过排列特性重要性(PFI)，深度特征选择(DFS)和其他一些技术来寻找提升预测准确度的最重要特征。这些时钟也被用来评估各种数据类型的群体特异性。
本研究的目的是基于全基因组测序(WGS)和多项其他数据，使用机器学习的方法，检验微生物群落的演替模式，构建一个年龄预测模型。在本文中，我们基于宿主微生物组构建了一个估计宿主年龄的方法，可以评估在宿主衰老过程中特定微生物类群的重要性，并提供合适的微生物干预措施建议。
研究方法
数据获取
在本研究中，作者只选择了已经公开发表，并可以在ENA和SRA两大数据库中获得的的人类宏基因组测序(WGS)研究项目，在这些项目中，只有有年龄信息的健康个体的样本被纳入研究。这些健康人分别来自于澳大利亚、中国、丹麦、法国、德国、哈萨克斯坦、西班牙、瑞典和美国，年龄介于20到90岁之间。最后，总共有来自于1165个健康人的3663份样品被整合到分析之中。数据分布如Figure 1所示:
Figure 1
神经网络训练
Neural networks training
回归
Regression
所有的深度神经网络(DNNs)分析都是使用Python 3.6 Keras库中的Tensorflow实现的。利用包含1673个微生物类群的物种特征的完整数据来训练特征选择模型。在后续所有分析中，训练集和验证集分别包含所有数据集的90%和10%。分别构建了两个回归器:一个使用来自单个样本的分类特征数据(基于样本的模型)，另一个使用来自同一宿主所有样本的平均值的分类特征数据(基于宿主的模型)。采用五倍交叉验证的方式训练回归器模型。在对各模型配完成网格搜索后，根据R^2的最大值选择性能最好的模型。采用基于样本的模型确定最好的模型结构，共包括3个隐藏层，每层包含512个节点，PReLU激活函数、Adam优化器，每层dropout率为0.5，学习率为0.001（Figure 2）。相同的结构参数用于基于宿主的模型中。使用Python库中的XGBoost梯度提升方法来验证来自基于样本的DNN模型的特性的重要性。最优的XGBoost模型使用如下参数p: linear_nthread = 35， max_depth = 6， max_delta_step = 2， lambda= 0， gamma=0.1， eta=0.1， alpha = 0.5。XGBoost模型的表现采用MAE评估.
Figure 2
分类
Classification
年龄分类器模型分别使用95个特征或39个特征的子集进行训练。训练和验证分别包含所有数据集的80%和20%。使用Python Keras库的Tensorflow后端实现年龄分类器的训练。加权的F1评分作为评价模型性能的指标。Figure 3展示了性能最优的结构。对于包含95个特征的分类器，3个隐含层分别包含128、32、8个节点，dropout率0.5，隐含层为PReLU激活函数，输出层为softmax激活函数54。对于包含39个特征的分类器，2个隐含层分别包含64和8个节点，dropout率0.5，隐含层为PReLU激活函数，输出层为Softmax激活函数。
Figure 3
过采样
Oversampling
在建立年龄预测模型时，为解决分类不平衡的问题，我们采用了过采样的方法。使用Python库Somoclu模块为每个年龄组构建了基于零一特征(如果在样本中检测到一个分类单元，则为1，如果没有检测到，则为0)的自组织映射（Self Organizing Maps; SOM)。每个SOM由放置在环形栅格上的100个格组成。为了使代表不足的分类产生合成特征，代码本向量（codebook vectors）是随机选择的，并根据映射到它们的最佳匹配单元(BMUs)的数量进行替换。代码本值用作将某个物种包含到假样本中的概率。然后Fake presence/absence特征乘以相应BMUs的平均丰度向量并进行归一化。
特征重要性
Feature importance
为了评估单个特征的重要性，我们采用了重排特征重要性(Permutation feature importance， PFI)技术。PFI通过对单个特征向量的排列来测量预测质量的变化(R2评分降低)。质量信号下降越多，该特征越重要。这些被认为是最重要的特征进一步采用累积局部效应(ALE)的方法评估，以确定微生物物种丰度发生微小变化时年龄预测的变化。ALE方法采用如下算法实现：对所选的95个物种，每一个物种组成一个分位数值表(5%步展)。每个分位数的局部效应(LE)是通过测量预测的平均变化来计算，这些预测方面的变化是通过左右边界值代替观测特征的丰度实现的。每个分位数的ALEs是通过将前面所有的LEs相加并以结果为中心使每个分类单元的平均效应为零来计算的。
研究结果
机器学习预测年龄
为了研究人类肠道分类特征与实际年龄之间的关系，我们从10个公开数据集中收集了1165个健康个体(总共3663个样本)的完整元基因组序列。在我们的数据集中，所有人的年龄都在20到90岁之间，平均年龄为46岁。将3663份样本随机分为训练集(90%)和验证集(10%)，利用1673种微生物的相对丰度向量，训练深度神经网络回归器预测宿主年龄。最佳模型的MAE为3.94年，R2为0.81(Figure 5A)。然后我们将样本分为20-39岁、40-59岁和60-90岁三个年龄组，发现模型生成的预测年龄分布与实际年龄分布非常吻合(Figure 6)。
Figure 5
Figure 6
为了验证DNN的结果，我们还采用了随机森林、支持向量机和弹性网络回归方法进行验证。与DNN方法相比，所有这些方法的效果都很差（平均绝对误差超过11年）。除此之外，我们还训练了一个与DNN模型(MAE = 4.69 years， R2 = 0.81)精度相当的梯度增强(gradient boost， XGB)回归器(regression)(Figure 5B)。这两种方法都倾向于预测中位年龄-46岁(Figure 6)。由于地理位置或饮食类型的不同，尽管在分类特征中存在某些差异，但所描述的预测因子同样适用于来自不同人群的成年人(见补充材料)。
微生物对年龄预测的影响
利用重排特征重要性(PFI)，我们评估了哪些类群的丰度在微生物年龄预测中发挥了最大的作用。我们确定了95个物种，这些物种使XGB和DFS模型的R2评分降低了>0.001(Figure 7)。从PFI评分来看，DNN回归器对高度丰富的物种更为敏感，而XGB回归器最重要的特征中包含了一些小类群。与其他方法相比，这表明DNN具有更强的稳定性。95个分类单元的得分值、丰度和富集度的完整列表见补充表1。
Figure 7
为了描述这95个特征是如何影响年龄预测的，我们使用了累积局部效应(ALE)方法(Figure 4)。ALE方法测量回归因子对特定类群丰度变化的响应。每个特性的ALE的计算仅使用丰度> 1e-5的特征值计算。一些微生物物种随着年龄的增加其数量稳步增加(如[Eubacterium] hallii); 其他微生物则与预测年龄(如Bacteroides vulgatus)呈负相关(Figure 8)。有趣的是，之前被PFI鉴定为重要的某些微生物对预测年龄(如[Eubacterium] rectale)影响很小(Figure 8)。
Figure 4
Figure 8
使用ALEs，所有特征均可分为seno-positive(单调递增ALE图)、seno-negative(单调递减ALE图)和更复杂的类群(非单调情况)(Figure 9)。在95个物种中，只有39个物种在5%-95%分位数范围内显示预测年龄大于1岁的平均变化，其中21个为seno-positive，15个为seno-negative，3个为非单调。
Figure 9
DNN预测年龄
尽管在包含所有分类群的数据集上，DNN和XGB回归器均表现出可接受的精度，但是在训练过程中，当特征的数量下降到100以下时，会产生表现不佳的模型(MAE> 11年)。为了估计95个和39个标记物种(Figure 9)，我们应用一个更容易的任务年龄段预测。所有样品按年龄被分为三组:年轻(20-39岁，占32%)，中年(40-59岁，占41%)和老年(60-90年，占27%)。代表不足的分类采用过采样方法(见方法)。
在这种设置下，表现最佳DNN模型表现出比随机分配年龄组更优的预测精度。随机模型的平均加权F值不超过38±1%，而95个标志物种的模型的F值达到67±4%。使用ALEs方法将标志物种降低到39个时，F值仅降低了5%(62±3%)。我们还比较了使用ALEs筛选的39个标记物种集所构造的分类器与随机选择39个物种所构建的分类器的优劣。结果显示随机产生的100个数据集没有产生一个与ALEs选取物种(38±3%)一样好的分类器。(Figure 10)
Figure 10
基于宿主的年龄预测模型
尽管DNN已经很准确，但是由于数据不足，在训练过程中每个样本均被视为独立的样本。通过将来自于同一个宿主的数据平均化可以消除存在的数据污染问题，这使得样品总数减少到1165个。基于宿主的年龄预测模型采用基于样品的年龄预测模型所得到的最优参数进行配置(Figure 2)。结果显示：基于宿主预测年龄的模型准确性要低于基于样品的年龄预测模型，MAE为8.56年(Figure 11)。但是该模型仍然好于基线年龄分配(MAE=12.47年)。有趣的是，男性和女性标本得到相同的准确性，并且预测的肠道年龄与BMI呈正相关(r = 0.23)，这一点符合现有的数据中BMI和生物年龄之间的关系，但是，这种相关性低于样本BMI与实际年龄:r = 0.3。
Figure 11
结论
本研究证明采用机器学习方法使用人体肠道菌群特征预测年龄是可行的，最优的DNN模型的MAE仅为3.94年。此模型与前人的年龄预测模型具有可比性，例如图像预测年龄模型（PhotoAgeClock）的MAE为1.9，最优的甲基化年龄预测模型（methylation aging clock）的MAE为2.7，转录组年龄预测模型（transcriptomic aging clock）的MAE为7.8，血液年龄预测模型（hematological aging clock）的MAE为5.5。此外，本研究还开发了一个微生物特性选择和注释的方法，此方法基于DNN训练模型，采用PFI和ALE两种方法对重要性进行评估。这种方法可以同时选取最相关的特征作为生物标志物并且量化其对目标变量的影响，例如本文中的年龄。基于这种方法，我们发现95个和39个原核生物类群的生物标志物可以很好的预测肠道年龄。尽管当将整个物种群包含进模型中时，预测能力降低，但是它可以准确（86%）将数据分配到三个年龄组(年轻、中年和老年人)，比随机分类模型更准确(F值分别为0.71和0.34)。
本文所确定生物标志物（物种）的丰度，有些与年龄正相关，有些与年龄负相关，。这些物种在将来研究中应该得到更多的关注，将为我们进一步理解人类衰老与肠道微生物的关系提供帮助。
Science新闻介绍
我们知道数以亿计的细菌以我们的肠道为家，它们可以调节我们消化食物的能力，也可以调节我们免疫系统的功能。尽管肠道菌群与疾病的相关研究已经很多，但科学家们对这个被称为微生物组的系统是如何随时间变化的却知之甚少，甚至不知道一个“正常”的系统应该是什么样子。现在，研究人员对全球数千健康人的肠道细菌进行了研究，并得出结论:微生物组是一个非常精确的生物钟，能够预测大多数人的年龄并且预测误差仅为4年。
为了发现微生物群是如何随着时间变化的，研究人员亚Alex Zhavoronkov和他的同事们对全球1165名健康人的3663多个肠道细菌样本进行了研究。在这些样本中，大约三分之一的人年龄在20岁至39岁之间，三分之一的人年龄在40岁至59岁之间，三分之一的人年龄在60岁至90岁之间。然后科学家们用机器学习的方法来分析数据。首先，他们采用90%的样本对深度学习的算法进行训练，结果发现有95种不同的细菌可以很好的预测人的年龄。然后，他们算采用剩余10%的样本对深度学习算法的准确度进行验证，结果发现此算法可以很好的预测人的年龄，误差在4岁以内。进一步的研究发现，在95种细菌中，39种细菌是预测年龄最重要的。
Zhavoronkov和他的同事们发现，随着人们年龄的增长，一些细菌增加了，例如Eubacterium hallii，此菌被认为对肠道的新陈代谢很重要，而有些细菌则减少了，例如Bacteroides vulgatus，通常这种细菌与溃疡性结肠炎(消化道的一种炎症)有关。哈佛大学研究衰老问题的生物学家（也是此论文共同作者之一）Vadim Gladyshev说，饮食、睡眠习惯和体育活动的变化可能是细菌种类变化的原因之一。Zhavoronkov说，这种“微生物组年龄时钟（microbiome aging clock）”可以作为基线，用来测试一个人肠道衰老的快慢，以及酒精、抗生素、益生菌或饮食是否对寿命产生影响，也可以用来比较健康人与某些患有疾病（例如阿尔茨海默氏症）的人的肠道菌群，看看他们的微生物群是否偏离正常。如果这个想法被证实，它将与其他生物标记（包括端粒的长度以及DNA表达的变化）一起被科学家用来预测生物年龄。将这种新的年龄时钟与其他生物标志物结合起来，将能更准确地展示出一个人的真实生理年龄和健康状况。它还可以帮助研究人员更好地测试某些干预（包括药物和其他治疗）是否对衰老过程有影响。
计算机科学家、微生物组研究专家、加州大学圣地亚哥分校微生物组创新中心主任Robin Knight表示，通过肠道微生物组来预测一个人的年龄的想法“非常合理”，而且对研究衰老的科学家“非常有吸引力”。目前他的团队也正在分析来自美国肠道项目(American Gut Project)的1.5万个样本，该项目是他创立的一项全球微生物学研究，目的是开发类似的年龄预测因子。但Knight也补充说，开发这样一个时钟的挑战之一是，世界各地的人的肠道中的细菌存在着巨大的差异，在明显不同的人群中重复这类研究更为重要，可以发现不同人群中是否存在不同的年龄预测信号。目前还不清楚是微生物组的变化导致人们衰老得更快，还是这些变化仅仅是衰老的副作用。目前，In Silico Medicine正在基于机器学习构建几个可以与微生物组相结合的年龄时钟。Zhavoronkov说：“我们每一秒都在改变，年龄是所有疾病的一个重要参数。”
Reference
Fedor Galkin， Alexander Aliper， Evgeny Putin， Igor Kuznetsov， Vadim N Gladyshev， Alex Zhavoronkov. 2018. Human microbiome aging clocks based on deep learning and tandem of permutation feature importance and accumulated local effects. bioRvix doi: https://doi.org/10.1101/507780
Emily Mullin. 2019. The bacteria in your gut may reveal your true age. Science 01-11 http://www.sciencemag.org/news/2019/01/bacteria-your-gut-may-reveal-your-true-age
热心肠日报——Science新闻：肠道菌群，你的微生物“生命之钟” https://www.mr-gut.cn/papers/read/1099651870
译者简介
陈亮，博士。2010年毕业于鲁东大学生物技术专业，2017年于中国科学院微生物研究所获微生物学博士学位。目前就职于中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室，生物信息和计算生物学研究组，任助理研究员，目前主要研究内容为微生物生态学、宏基因组学等方面的数据挖掘和分析。在宏基因组公众号发表《一文学会网络分析——Co-occurrence网络图在R中的实现》等。
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