胎盘功能障碍常导致不良妊娠，然而导致胎盘功能障碍的原因尚不清楚。过去的多篇报道认为胎盘微生物群的改变可能与不良妊娠相关【1-3】，然而这与前测序时代的观点相悖——胎盘通常是无菌的【4】。那么究竟胎盘中是否存在微生物组？“胎盘微生物组”是否会与不良妊娠有关？2019年8月1日，Wellcome Sanger研究所Julian Parkhill和剑桥大学Gordon C. S. Smith的科研团队在Nature 杂志发表题为Human placentahas no microbiome but can contain potential pathogens 的文章，该文章通过537个孕妇胎盘样本证明了：1）人胎盘不具有微生物组。2）胎盘的细菌感染不是导致不良妊娠的主要原因。3）在围产期（怀孕28 周到产后一周），胎盘是与新生儿败血症相关的无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）的潜在定植位点。该团队研究了两组患者的胎盘样本。第一组包括20名患有先兆子痫（妊娠24周左右，在高血压、蛋白尿基础上，出现头痛、眼花、恶心、呕吐、上腹不适等症状者）的患者、20名小于胎龄儿（Small for gestational age，SGA）患者和40名匹配对照。作者在所有样本中加入了沙门氏菌（Salmonella bongori）作为阳性对照，然后用宏基因组和16s rRNA基因扩增子测序两种方法进行测序分析。第二组包括100名先兆子痫患者，100名小于胎龄儿患者、198名匹配对照（其中2名对照使用2次）和100名早产患者的胎盘样本，所有样本均采用两种试剂盒（the MP Biomedical kit和Qiagen kit）提取DNA并用16S rRNA基因扩增子测序进行测序分析。
第一组实验：宏基因组与16S rRNA基因测序比较作者将80个样本分成10个批次，每个批次8个样本。主成分分析表明宏基因组学数据中98%的变异都可以被主成分1（80%）和主成分2（18%）解释（图1a）。而这种差异并非样本差异而是批次效应造成的（图1b）。具体地，热图显示10个批次中有8个批次具有明显的大肠杆菌信号和其他额外的细菌信号，同时还有强烈的噬菌体PhiX174信号（Group1蓝色标记，注：PhiX常用于扩增子测序中增加序列多样性的平衡序列以保障测序质量）。对大肠杆菌信号深入分析发现所有的大肠杆菌信号都来源于同一菌株，提示可能是由于污染导致。8个批次中的2个批次，即第4和第5批次的样本还显示了强烈的慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）和沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)信号（Group2，紫色）。第8和第9批次样本缺乏上述信号（Group3，黄色），但是其中有两个样品具有强烈的人类β疱疹病毒6B（HHV-6B）信号，可能是由于染色体整合病毒遗传造成，而西方人群中有0.5-1%的个体会发生该现象。图1 宏基因组和16S rRNA扩增子测序的批次效应比较宏基因组和16S rRNA基因测序的结果发现，两种方法中完全一致的信号仅有阳性对照沙门氏菌（S. bongori，阳性对照）。基于kappa一致性检验发现在其他细菌中仅有无乳链球菌（S. agalactiae）和地热球菌（Deinococcus geothermalis）具有较高一致性。在宏基因组学数据中检测到14个样本带有霍乱弧菌(Vibrio cholerae)信号，11个样本带有肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）信号。分析表明与其序列最匹配的菌株分别来自孟加拉国的菌株PRJEB14661霍乱弧菌和全球肺炎球菌序列项目的PRJEB31141 肺炎链球菌，而它们都曾在本项目的同一测序管道(lane)中进行过测序，表明这些信号可能源于文库制备或测序过程中的交叉污染。第二组实验：基于不同DNA提取试剂盒的16S rRNA基因测序比较比较两种DNA提取试剂盒的16S rRNA测序结果，发现仍然具有批次效应。Bradyrhizobobium在一些批次中均检测到较高丰度而在另一些批次中相对较低。而伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia），一种之前被认为与早产相关的细菌，不同的试剂盒显示的信号强度不同，对大多数常见菌，两种DNA提取方法间结果的一致性较低。而针对从生态学角度出发，可信度较高的物种，如无乳链球菌（S. agalactiae）和李斯特菌（Listeria monocytogenes），阴道乳酸杆菌，阴道病相关细菌，粪便相关细菌和一些可能的口腔细菌均具有相对较高一致性，表明它们是来源于样品而非污染，但是不同的DNA提取方法会影响它们的信号强度。进一步，研究团队分析发现阴道乳酸杆菌与分娩方式有关，表明该类细菌可能是在分娩和分娩期间引入的污染。结合临床信息，发现在不同方法中具有较高一致性的无乳链球菌（S. agalactiae）与不良妊娠没有关系。同时，还通过巢式PCR和qPCR方法对无乳链球菌表面免疫原性蛋白（surfaceimmunogenic protein，SIP)进行检测，发现有7个样本PCR和16S rRNA基因测序结果均为阳性，255个样本PCR和16S rRNA基因测序的结果均为阴性，14个样本PCR结果显示阴性，16S rRNA基因测序结果为阳性，kappa检验结果显示0.48的一致性（kappa结果范围为0-1，1代表完全一致）。造成不一致的原因可能是由于无乳链球菌基因组有6个拷贝的16S rRNA基因但是只有一个拷贝的SIP蛋白，所以相比PCR，16S rRNA扩增对该细菌的敏感性可能更高。通过上述实验与分析，该团队最后确定了5种可能的污染模式（图2）：1、在分娩和分娩期间，细菌或细菌DNA造成胚胎污染（如Lactobacillus）2、在样品采集过程中如使用PBS洗涤活检组织造成的污染（如D. geothermalis）3、在样品处理过程中如提取DNA的过程造成的污染（如B. silvatlantica）4、在文库构建的过程中，如测序前对DNA的扩增造成的污染（如T. halophila）5、测序设备造成的污染（如V. cholerae）该研究为人胎盘中不具有微生物组提供了有力支持，同时为其他微生物组实验的采样、处理、测序过程提供了指南和提示，在后续微生物组的研究过程中我们应该更加注意如何避免污染并且降低、消除批次效应以得到更多正确的科学结论。https://doi.org/10.1038/s41586-019-1451-5
1. Aagaard, K. et al. The placenta harbors a unique microbiome. Sci.Transl. Med. 6, 237ra65 (2014).2. Antony, K. M. et al. The preterm placental microbiome varies inassociation with excess maternal gestational weight gain. Am. J. Obstet.Gynecol. 212, 653.e1–653.e16 (2015).3. Collado, M. C., Rautava, S., Aakko, J., Isolauri, E. & Salminen, S.Human gut colonisation may be initiated in utero by distinct microbialcommunities in the placenta and amniotic fluid. Sci. Rep. 6, 23129 (2016).4. Perez-Muñoz, M. E., Arrieta, M. C., Ramer-Tait, A. E. & Walter, J.A critical assessment of the “sterile womb” and “in utero colonization”hypotheses: implications for research on the pioneer infant microbiome.Microbiome 5, 48 (2017).猜你喜欢
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