NBT：南农突破成果—噬菌体：土壤“狙击手”激发根际防御军团(附视频)
近些年，集约化农业发展中的不合理措施，如化肥农药的持续过量投入以及经济作物的单一连作等，导致土壤微生物群落结构严重失衡，生态功能急剧削弱。土壤养分周转不畅、污染难以消解、土传病害频发就是土壤微生态失衡重要证据，这些也是农业资源与环境领域亟待解决的难题。以青枯菌（Ralstonia solanacearum）引起的土传青枯病为例，青枯菌在土壤中存活时间长，能侵染番茄、茄子、辣椒、烟草、生姜、花生等400多种植物，导致作物减产，甚至绝收（图1）。传统化学农药和熏蒸等方法短期内见效快，但病原菌容易形成耐药性；再加上农药和熏蒸剂靶向性不强，在杀灭病原菌的同时也破坏了土壤正常的微生物群落，影响土壤微生物的生态功能，很可能导致病原菌二次侵染时造成的危害更大。
图1 土传青枯病在全国分布范围广、危害严重
那么能否找到既能精准猎杀土壤病原菌，又不破坏土壤微生物群落结构和生态功能的环境友好型措施呢？这是可持续农业发展亟需的土传病害防控技术：“精准治疗+生态友好”。我们聚焦到“噬菌体”这一特殊土壤微生物上。噬菌体是一类专性侵染细菌的病毒，在环境中普遍存在，其数量级可达109/g土。噬菌体能够特异性侵染宿主细菌，可以实现对特定病原菌的精准裂解，并且能够动态压制病原菌数量。目前，国内外不少学者在医学、养殖、果蔬保鲜、农业病害防控等领域都做了大量尝试，通过噬菌体抑制病原细菌的方法行之有效。但土壤环境复杂，如何提高噬菌体疗法在土传细菌性病害防控中的效果还有待研究。更为重要的是，噬菌体在土壤中抑制土传病原菌的作用机制并未阐明清楚。
为解决这些问题，本实验室首先从广西、江苏、浙江和江西不同地区分离到1000多株病原青枯菌，并筛选到能高效裂解病原菌的噬菌体。其次，根据噬菌体的来源和侵染特性选择了4株噬菌体为材料，组合成不同多样性的噬菌体组合，以提高噬菌体疗法的效果。通过温室和大田研究，发现噬菌体组合能够显著降低青枯病的发生，且防控效果随噬菌体组合丰富度的增加而提高（图2）。
图2 噬菌体鸡尾酒对番茄土传青枯病的防控效果：温室盆栽（A）和大田试验（B）
为什么噬菌体组合能够有效防控土传青枯病呢？分析发现番茄经噬菌体组合处理后，根际病原青枯菌数量显著降低，并且组合多样性越高，病原菌成功突变抵御噬菌体的概率越低（图3A, B）。即便有一些青枯菌成功突变、残存了下来，但它们的生长显著减缓（图3C, D），这说明它们与土壤中其它微生物竞争的能力减弱，再次侵染作物根系的能力会下降。因此，噬菌体组合猎杀并致弱病原菌是其在根际发挥作用的一个重要机制。
图3 噬菌体鸡尾酒对根际病原菌的影响：病原菌数量（A）、突变率（B）、对噬菌体的耐受性（C）及生长与耐受性之间的相关性（D）
当大量病原青枯菌被猎杀时，宿主相关微生物群落发生了什么变化呢？这种变化对宿主植物健康有利吗？这是噬菌体疗法领域必须回答的问题，既涉及到生态风险，也涉及到作用机制。我们发现噬菌体组合显著改变了根际细菌群落结构，细菌群落多样性随噬菌体组合多样性的增加而增加（图4），说明噬菌体组合对细菌群落的影响是积极的。
图4 噬菌体鸡尾酒对根际微生物群落结构（A）和多样性（B）的影响
细菌群落为什么发生了这么大的改变，是不是噬菌体也能侵染土壤中其它细菌？答案是否定的，从土壤中分离了400株细菌，青枯菌噬菌体都不能侵染这些细菌，说明这四株供试噬菌体的侵染特异性很强（图5），不能侵染非宿主细菌（即只侵染青枯菌）。
图5 分离自根际的400株细菌（A）及噬菌体对非宿主细菌的侵染性（B）
同时我们也发现单独接种噬菌体对土壤微生物群落扰动很小，但是接种病原青枯菌会导致土壤群落结构发生巨变，并且多样性显著下降（图6）。不过，这种影响可以被噬菌体修复，被破坏的微生物群落多样性可以恢复提升到原有水平。说明噬菌体是通过影响宿主病原菌，间接影响土壤微生物。于是，我们推测噬菌体在根际有效猎杀病原青枯菌，释放出大量空间和资源，其他微生物又占据这些空间和资源，所以土壤微生物群落结构发生了变化。
图6 噬菌体鸡尾酒对根际微生物群落结构（A）和多样性（B）的影响（室内验证）
深入分析发现并不是所有的土壤微生物都有机会重新获得被噬菌体释放出的空间和资源，细菌群落中那些竞争能力强（如产抑菌物质能力强）的一类物种似乎在群落结构调整中获得了优势，它们的丰度随噬菌体组合多样性的增加而增加，可能进一步提高了群落的抑病能力（图7）。这些竞争能力强的微生物群体可能与噬菌体一起共同抵御病原菌的再次入侵，有效维持了作物的健康。
图7 噬菌体鸡尾酒选择性富集根际抑菌能力强的细菌
我们的研究表明噬菌体不仅可以“专性猎杀”和“精准靶向”病原菌，降低其生存竞争能力；同时还能够重新调整根际土壤菌群的结构，恢复群落多样性，增加群落中拮抗有益菌的丰度。这就相当于，不仅找到了精确制导病原菌的“狙击手”，同时还触发了根际免疫，让被打垮的根际菌群又组建了一支“防御军团”！这将为应用推广噬菌体疗法作为精准靶控、生态安全的土传病害防治措施提供重要的理论依据。
图8 噬菌体鸡尾酒激发根际免疫的机制
作者简介
沈其荣教授
沈其荣简介：南京农业大学学术委员会主任，长期从事土壤微生物、有机肥和生物有机肥研究。提出和建立了土壤微生物区系调控的理论和技术体系，并研发出调控土壤微生物区系的有机（类） 肥料系列产品（有机肥、有机无机复混肥、生物有机肥、全元生物有机肥），相关技术工艺已被全国600 多家企业采用；研发的土壤熏蒸与生物有机肥联用防治土传病害综合技术效果显著，为中国土壤生物肥力提升和有机（类）肥料产业发展做出了重大贡献。以第一完成人获国家技术发明二等奖1项、国家科技进步二等奖1项、国家专利金奖1项、国家专利优秀奖1项、国家教学成果二等奖1项以及省部级一等奖8项。以第一和第二 完成人获中国发明专利60多件、国际PCT专利6件，其中50多件专利在企业 得到转化。发表SCI论文400多篇，H指数50，2014年-2018 年连续五年入选 ELSEVIER中国高被引学者榜单。获全国创新争先奖状、国家教学名师、全国师 德先进个人、全国优秀科技工作者、江苏省劳模和先进工作者、农业部和江苏省突出贡献专家、江苏省十大杰出发明人和江苏省首届发明人奖。已累计培养硕士研究生121 名、博士研究生83 名。目前和曾经兼任：国家973 计划首席科 学家、 国家863 计划现代农业领域主题专家、第六届和第七届国家自然科学基 金委生命学部专家咨询委员会委员、 第七届国务院学位委员会农业资源与环境 学科评议组召集人、中国有机（类）肥料产业技术创新联盟理事长、中国土壤 学会副理事长、中国植物营养学会生物与有机肥专业委员会主任、农业部耕地 质量建设与管理专家组组长、教育部和农业部科技委委员、中国农科院学术委 员会委员、江苏省自然科学基金委农业学科组组长等社会职务。
韦中副教授
韦中副教授致力于从事根际微生态与调控研究，近年来在益生菌与病原菌互作和益生菌群构建等方面取得了重要创新成果，为开发新型高效稳定的复合功能微生物生物产品和调控根际微生态提供了方法学基础。先后入选南京农业大学钟山学术新秀、中国科协托举人才工程、江苏省青蓝工程优秀青年骨干教师培养对象和江苏省优青和国家自然科学基金优秀青年项目。近五年，在国内外发表论文40多篇，其中以第一或通讯作者在 Nature Biotechnology、Science Advances、Nature Communications、Trends in Plant Science、mBio、Environmental Microbiology 等本领域国际主流刊物上发表SCI论文10余篇，7篇代表作累计影响因子(IF5-year)100+。申请专利9项，其中已授权发明专利5项。自2013年起，先后与荷兰乌特勒支大学、英国约克大学、法国农科院、荷兰生态中心、韩国东亚大学等建立合作关系，参加与研究领域密切相关的国内外学术会议和研讨会20多次，其中口头报告10多次。
论文信息
原名：Phage combination therapies for bacterial wilt disease in tomato
译名：噬菌体组合防控番茄土传青枯病
期刊：Nature biotechnology (2019)
IF5y：45.12
发表时间：2019.12
通讯作者：韦中，沈其荣，Ville Petri Friman
第一作者：王孝芳，韦中
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