广东省生态环境技术研究所孙蔚旻团队: 梯田土壤微生物对不同酸性矿山废水侵蚀作用的响应机制

第一作者：徐锐

通讯作者：孙蔚旻

通讯单位：广东省生态环境技术研究所

论文DOI: 10.1016/j.envpol.2020.114226

第一作者：孙蔚旻

通讯作者：孙蔚旻

通讯单位：广东省生态环境技术研究所

论文DOI: 10.1016/j.envint.2020.105601

图文摘要

AMD侵蚀作用下的土壤微生物代谢途径模式图。

全文速览

广东省生态环境技术研究所孙蔚旻研究团队针对受酸性矿山废水严重侵蚀的土壤环境，采用宏基因组学方法揭示了微生物群落结构及潜在代谢途径的变化过程，提出了土壤微生物对极端环境的适应机制。

引言

贵州黔南地区由于长期的采矿作业，大量的酸性矿山废水 (Acid minedrainage，AMD）经由尾矿排放到了下游环境。AMD因具有强酸性、重（类）金属含量高等特点，可对周边农用土壤环境造成巨大污染，如导致土壤酸化、土壤肥力下降、作物减产等不利后果。土壤微生物对于调控土壤物质循环与生态平衡具有重要作用。部分土壤微生物菌群进化形成了独特的生存策略，从而适应AMD这类极端环境。揭示这类土壤微生物的群落结构组成与代谢特征对于AMD污染的响应机制，有助于理解AMD的微生物修复过程。本项目选取了一块位于AMD核心污染区域的梯田作为研究场地，该梯田沿垂直海拔从下至上遭受了不同程度的AMD污染侵蚀（由重至轻）。研究首先利用扩增子测序、共线性网络分析及随机森林模型揭示了AMD对土壤微生物的菌群多样性、相对丰度及群落互作模式等的影响机制（EP篇）。然后进一步基于宏基因组学分析方法和微宇宙实验，揭示了不同的AMD污染梯度下，土壤微生物编码碳循环、氮循环、重金属抗性等代谢过程中功能基因的差异特征（EI篇）。本研究从多角度、多层次揭示了土壤微生物的生存策略可根据不同的AMD侵蚀作用而发生显著变化，并在此基础上提出了AMD生境中土壤微生物的代谢模式图。相关研究成果分别刊发在最新一期的Environmental Pollution（IF=5.741）和Environment International（IF=7.943）。

研究方法

1.研究场地与样品采集

本研究在贵州省福泉市某矿区附近选取了一块高约80 m的梯田，将其沿垂直海拔从下至上依次划为5等份（Field 1-5）。该梯田底部（Lower fields，Field 1 & 2）因长期遭受严重的AMD侵蚀，进而形成了与污染程度较轻的顶部（Upper fields，Field 3-5）截然不同的土壤理化特征。这样一个渐变的AMD污染条件为研究土壤微生物对极端环境的适应性机制提供了很好的研究样本。本研究从Field 1到Field 5，每层各采集9个样品（n=45)进行下游分析。

2.理化分析

分析指标包括：(1)常规土壤理化参数：pH、总碳、总氮、硝酸根、硫酸根、亚铁离子、铁离子、重（类）金属等。(2)基于微宇宙培养方法测定乙炔还原速率(Acetylene reduction assay, ARA)，以评估土壤微生物的固氮能力。（3）针对固氮基因*nifH*进行qPCR荧光定量。

3.扩增子测序

使用Illumina MiSeq双端测序平台（PE-250）对土壤微生物基因组的V4-V5区进行扩增测序，下机数据主要使用QIIME处理。使用UPARSE方法将序列按97%相似度聚类成OTU后，与Green Gene数据库比对注释。

4.宏基因组测序

使用Illumina Hiseq 4000双端测序平台（PE-150）对土壤微生物的宏基因组进行鸟枪法测序，下机数据经质控、剪切后用metaSPAdes和Bowtie2拼接组装。使用LCA(Last Common Ancestor)注释序列后比对KEGG、COG等功能基因数据库。

5.主要统计方法

（1）使用R包（indicspecies）鉴定各层的指示菌群（Indicator species analysis，ISA）；

（2）使用R包（RandomForest）构建随机森林模型用于预测理化因子与因变量(如目标菌群丰度、固氮速率等)的关系。

（3）基于R包（igraph）和Gephi/Cytoscape可视化工具构建理化因子与目标菌群/目标基因的共线性网络。

图文导读

Part I:土壤微生物群落对AMD侵蚀的响应机制

图1 梯田从底部（Field 1）到顶部（Field5）因受AMD侵蚀程度的不同，而呈现出明显渐变的土壤理化性质。越靠近底部pH越低（~2）、营养越贫瘠（低TN、TOC含量），而硫酸根和铁离子浓度则越高。表明AMD的长期侵蚀导致梯田Lower fields形成了极端的土壤环境。

图2 部分菌群（属水平）的相对丰度可随AMD污染梯度发生变化，表明它们对不同的AMD污染具有不同的耐受能力。此外，一些化能自养菌（Stenotrophomonas、 Corynebacterium、Ochrobactrum）可在重污染的Field 1中发生富集，表明微生物在极端环境下仍有着较为灵活的生存策略。

图3 基于土壤菌群OTU的共线性网络发现，微生物的互作模式在重污染Lower fields中相较于轻污染的Upper fields更强烈，例如Lower fields的网络links和节点nodes数明显更多。在两个互作网络中存在显著差异的节点微生物主要属于Acidobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria、Euryachaeota（Lower网络独有）和Bacteroidetes（Upper网络独有）五个门。

图4 利用随机森林模型预测微生物相对丰度对三个最主要的环境因子（pH、Fe（III）和硫酸盐）的响应关系。此处仅展示pH结果。发现诸如Anaeromyxobacter、Bradyrhizobium、Geobacter、 Rhodoplanes等在内的菌属丰度与pH正相关（蓝色标记），尤其是当pH>4时。相反地，一些菌属丰度虽与pH负相关（红色标记），但其最高丰度值却分布在不同的pH区间（2~4），表明这些菌群有着不同的嗜酸特性。

Part II:土壤微生物代谢途径对AMD侵蚀的响应机制

上述菌群结构的差异表明土壤微生物在不同的AMD污染条件下可能存在不同的代谢能力。因此本部分主要利用宏基因组学方法揭示了土壤微生物功能基因及代谢潜力随AMD侵蚀梯度变化所形成的差异，例如：                         

图5 参与编码六条主要碳固定途径（Carbon-fixation pathways）的基因丰度,在各层宏基因组样品中没有明显差异。表明AMD侵蚀对土壤微生物的固碳过程影响较小。整体而言，参与编码rTCA循环的基因丰度最高，可能是因为rTCA途径的能量需求（仅2个ATP）低于其他几条固碳途径(至少需要5个ATP，除Wood-Ljungdahl途径外)。因此在贫营养环境下，微生物倾向于使用能量转换效率更高的rTCA固碳途径。                      

图6 对固碳基因进行物种注释（order水平）后发现，Lower fields中参与固碳过程的微生物主要是Thermoplasmatales和Xanthomonadales。而在Upper fields中则主要是Rhizobiales。说明AMD污染侵蚀改变了固碳功能微生物的群落结构组成。                              

图7 基于ARA测试发现，Field 1中土壤微生物固氮能力最低。进一步基于随机森林模型发现，微生物固氮能力与TOC、硝酸盐、TN及pH呈现正相关，并与（重）类金属含量负相关，表明类似AMD这种极酸、贫瘠环境可显著抑制土壤微生物的固氮过程。

图8 通过比较氮循环编码基因，发现Lower fields中异化周质硝酸盐还原酶（napAB)和亚硝酸还原酶（nrfAH）的编码基因丰度减少。表明AMD侵蚀污染抑制了微生物的异化硝酸盐还原过程（DNRA），可能是因为Lower fields的TOC含量更低，导致在硝酸盐还原过程中充当电子受体的有机碳比例也更低。图9 通过比较硫循环编码基因，发现从Field 1下到Field 5，土壤硫含量的持续下降（图1）导致dsrAB和aprAB的基因丰度不断降低。表明硫含量是驱动土壤中生物硫还原的主要原因。此外，尽管普遍认为硫还原菌（SRB）的最适生长pH范围在5-9，但本研究却发现SRB及其相关还原基因可在极酸的Lower fields中发生富集。硫还原过程可提高环境pH，因此进一步揭示SRB及其生存策略有助于修复土壤AMD污染。                  

图10 共线性网络分析揭示了土壤理化因子与微生物代谢潜力（包括碳、氮、硫、金属代谢的编码基因）之间的关系。结果显示TOC、TS、Fe(III)、硝酸盐和pH是影响目标基因丰度的主要因素。例如本研究发现TOC不但影响了自养/异养细菌丰度，还与固碳基因rbcL正相关，并且影响了编码DNRA过程的amoABC、napAB、nrfAH等基因丰度。

结语

Embracing the unknown: 土壤微生物是构成生态系统的重要组成部分，对于能力循环和物质平衡具有无可替代的作用。然而，仅一克土壤就可包含数千种微生物，可见土壤微生物的群落特征与代谢机制十分复杂。虽然近年来基于标记基因、基因组和宏基因组的分析手段极大地扩展了我们对于土壤微生物组的认识，但大多数土壤微生物的生态策略仍然没有得到充分描述。特别是像AMD这类极端环境将如何塑造多样的土壤菌群？土壤微生物又可演化出何种相对应的生存策略？进一步阐明这些关键科学问题，将有助于我们管理土壤微生物菌群，提高土壤可利用性，并加深我们对陆地生态系统将如何应对环境变化的理解。 

作者简介

徐锐（助理研究员）：湖南大学与加拿大阿尔伯塔大学联合培养博士，现任职广东省生态环境技术研究所从事博士后研究，致力于从事宏基因组学技术以及环境功能微生物学原理等研究工作。相关成果累计发表高水平SCI 论文约40 篇，其中一作10 篇，累计他引约1200次（H-index=18）。主持国家级科研项目1项，省级1项。

孙蔚旻（研究员）：广东省生态环境技术研究所“土壤环境创新团队”中方负责人，中组部海外高层次人才，广东省珠江人才计划青年拔尖人才，主要围绕环境组学、DNA-SIP技术、重（类）金属与有机污染物的微生物代谢机制等方面开展了大量研究，相关成果已发表高水平SCI论文五十余篇，主要收录在Environmental Science & Technology（7篇），Environmental Microbiology（1篇），Environmental International (1篇)，Applied and Environmental Microbiology（6篇）等国际顶尖的环境科学和环境微生物学期刊。

原文链接

[1] Uncovering microbial responses to sharp geochemical gradients in a terrace contaminated by acid mine drainage. Rui Xu, Baoqin Li, Enzong Xiao, Lily Y.Young, Xiaoxu Sun, Tianle Kong, Yiran Dong, Qi Wang, Zhaohui Yang, Lei Chen,Weimin Sun. 2020, Envriomental Pollution, Volume 261: 114226.

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0269749119368253?via%3Dihub

[2] Bacterial response to sharp geochemical gradients caused by acid mine drainage intrusion in a terrace: Relevance of C, N, and S cycling and metal resistance.Weimin Sun, Xiaoxu Sun, Baoqin Li, Rui Xu, Lily Y. Young, Yiran Dong, Miaomiao Zhang, Tianle Kong, Enzong Xiao, Qi Wang. 2020, Environment International,Volume 138: 105601.

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412019338577

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