BMC：幼年特发性关节炎患儿肠道菌群的特征、生物标记的识别及其在临床预测中的作用
论文题目：Gut microbiota in children with juvenile idiopathic arthritis: characteristics, biomarker identification, and usefulness in clinical prediction
原文链接：https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-020-6703-0
杂志名称：BMC Genomics [3.5]
DOI: https://doi.org/10.1186/s12864-020-6703-0
第一作者：钱旭波[1]、刘永鑫[2]
通讯作者：卢美萍、张咸宁；
其他作者：叶小红、郑雯洁、吕邵霞、莫妙军、林金晶、王文琴、王未寒
作者单位：1、浙江大学医学院附属儿童医院风湿免疫-变态反应科；2、中科院遗传发育所
主编推荐语
以前已经有研究显示幼年特发性关节炎患儿（病例组）肠道菌群存在紊乱，但是这些研究结果不是很一致，而且病例组和对照组的性别、年龄均不匹配。然而，性别、年龄等恰恰是很肯定的混淆因素。本研究技术上有以下亮点：一是病例组和对照组进行了性别、年龄、BMI（体重指数）“频率匹配”；二是用人工智能的技术进行了生物标记识别；三是用“决策曲线分析”技术验证了模型的可靠性。结果发现病例组产短链脂肪酸细菌明显降低，且与临床风湿指标呈负相关；12个属可作为生物标记用于临床预测。
摘要
背景和目的：近年来的研究发现幼年特发性关节炎（juvenile idiopathic arthritis，JIA）患儿肠道菌群有紊乱的情况，但是前面这些研究均未匹配年龄、性别、BMI等因素，结果不是很一致。我们进行了一个性别、年龄、BMI频率匹配的横断面研究（cross-sectional study），分析了JIA患儿肠道菌群的特征，评估了其在临床预测中的作用。
方法：JIA患儿40例，对照组42例，年龄1~16岁，采用16S rDNA测序。用随机森林的方法进行生物标记识别，用受试者工作曲线（ROC）和决策曲线分析（decision curve analysis，DCA）方法评估模型效果。
结果：病例组α多样性下降；两组间β多样性指标Bray-Curtis dissimilarity有显著差异；病例组有4个属的细菌下降，这些菌与常用风湿指标呈负相关，而且这些菌均为产短链脂肪酸细菌；用随机森林方法筛选出12个属具有作为生物标记的潜力，用12个属构建的随机森林模型用于识别患者和非患者的ROC下面积是0.7975，DCA显示这个模型具有临床使用价值。
结论：JIA患儿存在肠道菌群改变，以4个产短链脂肪酸属细菌下降为特征；这4个属下降与更严重的风湿指标相关；12个属构建的模型可用于临床预测。
主要结果及图片解读
1、肠道菌群多样性改变情况
⑴α多样性改变：JIA组Chao 1和香农指数下降，两组差异显著。但是辛普森指数无显著差异。
⑵β多样性情况：经PERMANOVA检验，两组Bray-Curtis dissimilarity有显著差异。用Dirichlet-Multinomial Model进行了检验效能（power）分析，检验效能是0.89。
图1：两组多样性比较。
图A分别是Chao 1和香农指数箱线图，两组差异显著。图B是韦恩图，显示了两组有83个属是相同的，但是JIA组有3个属是独有的，对照组有8个属是独有的。图C为PCoA图，每个点代表一个样本，可见两种颜色的点聚集情况有不同，提示β多样性有差异。图D为发育树，显示了丰度＞0.3%的OTU，不同的“门”用颜色区分。
2、肠道菌群具体改变及与临床指标的关系
两组在“门”的水平并无差异。病例组Anaerostipes, Dialister, Lachnospira和Roseburia这4个“属”显著下降。差异分析方法用了ALDEx2，P值校正方法用了Benjamini–Hochberg。4个属与11个临床指标相关，主要呈负相关关系，相关系数绝对值在0.319~0.544之间。
图2：肠道菌群构成差异及其4个属与临床指标的相关性。
图A展示了两组在门和属水平的主要菌种构成。图B展示了4个属与每个临床指标的相关关系。图C是OTU的火山图，为两组OTU层面的构成差异分析情况，显示7个OTU丰度下降，效应值小于0.5。
3、生物标记识别及随机森林模型效果评价
在门、纲、目、科、属和OTU层面，发现用“属”构建的随机森林模型预测能力最强，其预测精度是67.9%，即袋外错误率是32.1%。用10倍巢氏验证法发现12个属是最合适的生物标记数量。按照变量重要性从大到小提取出这12个属，再用这12个属再次构建随机新的森林模型。新模型的预测精度是66.7%，AUC是0.7975，DCA分析显示其具有临床实用性。
图3：用12个属构建的随机森林模型可用作疾病分类器。
图A为巢氏验证法发现12个属是最合适的生物标记数量。图B为按照变量重要性排序图。图C为这12个属的相对丰度箱线图，这12个属包含了用ALDEx2分析发现的两组有显著差异的4个属。图D是用12个“属”构建的新模型的ROC分析图，灰色部分是95%可信区间。图E是DCA分析，红色的线就是新模型的净效益走势，可发现这条红色线一直在绿色和蓝色线上方，提示临床使用这个新模型用于临床后可获得净效益，有临床实用价值。
讨论
年龄是影响菌群构成的重要因素之一，特别是16岁以下儿童肠道菌群受年龄影响更加大。其他影响因素还包括性别、BMI、种族等。如果两组这些因素未匹配，则研究结果的可靠性低。这是本研究匹配了这些混淆因素的原因。由于完全的一对一匹配在临床实际中很难操作，本研究采用了频率匹配法。
在计算Chao 1和香农指数时，丰度低的物种有较大权重，辛普森指数则对普通物种权重大。本研究显示前2个指标有差异，而辛普森指数无差异，提示造成两组差异的主要原因是低丰度菌改变导致的。
Bray-Curtis dissimilarity差异检验的R2是0.02132，提示两组β多样性的差异有2.13%的原因是由JIA因素导致的。
单变量分析显示，JIA组4个属的细菌下降，它们在以前的研究中被证明是产短链脂肪酸细菌。短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸，它们具有显著的免疫调节活性，比如诱导Treg细胞分化，增加IL-10的产生，抑制Th17细胞等。而且给予丁酸盐的小鼠可抑制细胞因子产生，缓解关节炎症状。这些提示短链脂肪酸在JIA的发病中可能有重要作用。
本研究显示4个属的下降，而且下降越厉害，风湿指标越严重。这进一步验证了这几个属的细菌在JIA发生发展中的作用。
JIA的诊断是一件困难的事，多数情况下只能依靠病史、体检及排除其他疾病。我们发现12个属构建的随机森林模型可有效区分患者和非患者，但是以往评价模型都是使用ROC。但是ROC有个显著的缺点，即无法知道模型能否改善临床决策。2006年发明的DCA方法可有效解决这个问题。我们首次将DCA引入肠道菌群模型的评价，这尚属首次。DCA分析显示模型具有临床实用价值，可提高临床决策能力。
Reference
Xubo Qian, Yong-Xin Liu, Xiaohong Ye, Wenjie Zheng, Shaoxia Lv, Miaojun Mo, Jinjing Lin, Wenqin Wang, Weihan Wang, Xianning Zhang & Meiping Lu. Gut microbiota in children with juvenile idiopathic arthritis: characteristics, biomarker identification, and usefulness in clinical prediction. BMC Genomics 21, 286, doi:10.1186/s12864-020-6703-0 (2020).
文中统计分析使用代码：https://github.com/qianxubo/microbiota-stage-1
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