342.基于高通量技术的微生物组研究实验设计
基于高通量技术的微生物组研究实验设计
——微生物组研究，从方案设计到写作套路(二)
作者：王晓雯 凌波微课
版本1.0.2，更新日期：2020年9月22日
好文章离不开好设计
研究第一步就是要结合自己的研究目的和经费情况，选择适合的技术（可以参照上一节——基于高通量测序的微生物组研究技术简介，选择合适的技术类型），当然这与整个研究思路也是密切相关的。当确定了研究目的和想要说明的问题，下一步就是要考虑的，就是要捋清我们的研究思路，设计一个全面丰富的微生物组学研究方案了。
在近些年的微生物组学研究中，除了基于高通量测序的多组学研究，培养组学和生态表型研究也得到越来越多研究者的关注1。
但无论是哪种研究方向和何种研究策略，微生物组研究关注的核心，依旧主要集中在两个大方向-微生物组的群落结构和功能特征（包括下游验证 ）。
怎样才能让我们的研究更加丰满，获得更高水平的研究成果，进而发表更高质量的科研文章呢？就要整合我们的研究思路和合适的技术了。
完善的实验设计
火爆的微生物组，目前常见的研究多为多组学研究设计——整合不同层次的研究技术和手段，从微生物的构成、个体、基因、功能和分子机制，全面阐述一个微生物组的全貌，这样的设计大多有“套路”可循（如下）。
微生物组学领域的研究，在医学方向和环境方向分别有各自的特点。今天在这里就跟大家通过一些案例，来分别聊聊，在这两个常见的研究方向中，关于微生物组研究的那些或经典的、或独出心裁的方案设计！
环境类研究中常见的设计类型
例1: “低配”技术照样做出好文章
虽然高通量的技术专家，一般很乐于为研究者提供多组学关联的技术方案——既是研究的热门方向，又是发高分文章的好选择——但实际上，高通量技术选择“低配”版并不等同于实验设计和文章水平的“低配版”。
2020年发表于Science of the Total Environment(IF=5.589)的水生植物Vallisneria natans
对水深响应的研究就是一个经典代表2。
研究设计很简单也十分套路(下图)：在反应器中模拟不同水位深度进行植物的栽培，研究这些植物对培养水深的相应情况，针对微生物组的研究选择了最简单的16S rRNA基因测序。
这篇文章可以说是简单技术应用的经典。可以看出分组设计上是很中规中矩的，但是研究者丝毫没有放松对细节的要求——除了基础培养介质的安排,以及模拟湖底的黑暗环境外,在相关水质理化性质检测及植株的生理特征数据采集上也是颇下了一番功夫的。此外,研究还结合了扫描电镜的形态学观察和总有机碳的检测来说明微生物的附着（下图2）和有机碳的积累。
图注：扫描电镜显示不同水深度下植物表面生物膜的微生物附着情况2。
结合扫描电镜的微生物附着观察，利用扩增子测序手段检测不同微生物类群的分布——没有特别绚丽的作图，仅通过简单的柱状图和物种分布heatmap，直观展示出植株对不同培养水深的微生物群落分布响应情况。
图注：基于扩增子测序技术，不同水深培养条件下植株表面生物膜的微生物群落构成柱状图2。
在扩增子研究已经开展的如火如荼的大环境下，这篇文章依旧可以从详尽的环境理化因子的采集和整理分析入手，通过深入浅出的讨论，仅利用的高通量测序的扩增子技术就发表了影响因子达5分以上的文章，其明朗干脆的设计取样，完备的信息采集和逻辑清晰的讨论论述无疑起到了至关重要的作用。
例2:单一技术+多种分析（分箱+耐药基因分析）
这一篇文章是研究城市污水排放与抗生素抗性基因扩散的宏基因组研究，于2019年发表于Microbiome上3。研究重点关注城市生活于环境的相互作用，利用沿海城市污水和海滩取样，开展宏基因组测序，但没有局限于随机宏基因组的标准分析流程，研究把关注点转向了单菌基因组组装及抗生素抗性挖掘的方向。
主要实验设计和分组设计如下：
研究实验方法：随机宏基因组测序
研究分析方法：常规宏基因组分析+宏基因组分箱(binning)组装+ 宏基因组耐药基因(ARGs)注释
这篇研究的亮点在于通过多种分析方法，深入比对了两种样本的群落结构共性与特性特征，深度挖掘其中抗生素抗性基因的分布，深究城市污水及海滩样本中抗性基因的种类及丰度差异。
分析的多样化一样可以实现类似“多组学”研究的功能，此外，各种高大上的科研作图也是文章的亮点所在（瞅下边儿），而在微生物的宏基因组研究中，这些绚丽的作图都可以通过数据手段实现。如果研究的经费有限，设计也比较简单，那么这篇文章带给我们的启示是：不妨在多种数据分析和作图上多下功夫呦~
例3:经典的微生物多组学研究（扩增子+宏基因组+宏转录组+宏蛋白组）
说到多组学分析，土壤科学中必会提及的一篇宏组学研究当推2015年Nature发表的不同类型土壤微生物组研究4。通过对三种不同类型土壤的多组学研究（扩增子、宏基因组、宏转录组和宏蛋白组），展示三种土壤类型的物种及功能多样性分布。研究设计可谓是多组学研究的经典：
（备注： MG-宏基因组； MT-宏转录组；MP-宏蛋白组）
研究结果中更具有突破性的是——不仅仅展示不同类型样地的结果差异，还将不同技术手段获得的检测结果进行了多样化的比较和展示：
此外，研究中还引入的三元相图，维恩图等可视化方案，针对不同的土壤类型样本中存在的特色微生物类群进行研究，深度挖掘了土壤类型中的特征性微生物物种及功能，这也是目前的多组学研究中常见的比较方法——直观展现差异，挖掘差异来源，说明研究结果，得出最终结论。
例4: 从群体回归单菌的研究（分箱）
除多组学技术之外，由于培养组的兴起，越来越多的学者将研究的目光，聚焦在利用宏基因技术，获得单菌基因组组装结果的研究上。这里就包括基于纯算法组装的宏基因组分析算法和基于三维基因组技术的HiC-Meta技术。
2018年，Nature报道了利用宏基因组分箱技术开展的土壤细菌研究5，深度挖掘了新的土壤微生物类群及功能，结合宏转录组测序，报道了多元化的土壤次生代谢产物合成基因。
这篇文章主要偏微生物的功能研究，功能方面又是通过分箱组装，重点针对一些优势菌深入调研功能：研究获得了376株近乎完整的土壤微生物基因组序列，鉴定并发现了千余种生物合成基因簇及抗生素合成基因。通过DNA和RNA两个水平层面研究，深入讨论了土壤微生物组中的次生代谢产物合成潜力及功能。
分箱算法针对环境样本中的单菌基因组提供了较为低成本的研究路径，但针对环境中微生物之间的项目作用，研究环境微生物的质粒信息，抗生素抗性基因携带等，采用HiC-Meta技术则更胜一筹——HiC-Meta（又名ProxiMeta）方法除了可以获得更精确的单菌组装结果，更能将质粒与宿主基因组关联，监测抗性基因的水平转移，噬菌体侵染细菌等过程。在研究环境微生物的生态功能上具有重要意义。在2019年ISME发表的废水研究中6，研究者设计了两组研究：一组为污水样本，另一组在污水中定量加入含有特定质粒的大肠杆菌。利用HiC-Meta技术，开展了样本中优势微生物基因组的组装，并深入单菌水平，研究了污染水体中抗性基因的扩散情况及ARGs富集的菌体类型。一方面，研究利用加入的“内参”大肠杆菌评估了单菌组装的准确性（完整度>97%），并验证了这个方法可以将特定质粒与“内参”菌的关联：
既然在“内参”菌体中可以实现宿主与质粒、噬菌体与宿主菌的关联，那么这项技术自然可以用于“非分离培养”前提下宿主与ARGs的关联（如下图 示污水组的关联研究结果6）：
例6: 从群体研究实现单菌的培养组学和单菌研究（扩增子测序+宏基因组binning组装+单菌分离培养+单菌功能研究）
从群体，回归单菌，无疑是完成了微生物组研究中培养组关注的重要内容——在自然状态下保存微生物个体的本真，全面了解微生物的功能特征和营养方式，对下游的培养组（微生物分离培养）具有现实指导意义。此外，无论是基于Binning还是HiC-Meta获得单菌基因组的信息，都可以利用注释获得的单菌的抗性及代谢特征等转向指导单菌的分离培养，在下游研究中，就可以将分离的单菌用于基因组研究，诸如研究微生物的个性化功能、系统进化，比较基因组研究阐述不同菌株的基因组结构及功能差异等。
2018年，有学者利用宏基因组测序及分箱组装，探索富集培养中某优势菌的特殊生长倾向，并利用这种倾向，额外分理出Pimelobacter sp. LG209，结合菌株的分离培养，进一步通过功能培养实验揭示了Arthrobacter sp. D2和Pimelobacter sp. LG209在有氧降解磺胺嘧啶过程中的合作关系7（doi:10.1021/acs.est.7b05913, IF=6.198）。
图注：D2菌株单独培养和D2与LG209共培养对磺胺嘧啶（SDZ）降解和矿化的作用7。
动物和医学临床研究的设计思路：
类似的思考路线，医学微生物组研究也是循着从群落结构研究到分子功能及机制研究，再贯穿下游组学和其他技术手段验证的思路来开展的。
套路可以闪光辉，跳出套路之外，更能发挥出组学研究的万丈光芒~ 今天，就跟大家分享一些医学微生物组研究中，那些看似不经意却惊艳的研究设计。
例1：闪亮的“套路”
一个16 rDNA测序，能发多高水平的文章呢？ 还只有12对健康人与病人样本？
一篇针对肝硬化研究的项目告诉你，《AP&T》（IF=7.2）也可以！
2018年，《AP&T》发表的一篇丙肝药物对肝硬化患者肠道微生态的影响研究就“出套路而不俗”的脱颖而出8。研究只有三个分组：正常对照组、DAA治疗前HCV病患组和DAA治疗后HCV病患组。
Control | Cirrhosis HCV pre-DAA | Cirrhosis HCV post-DAA |
就这样简约的分组，病患只有12例病人样本，16s rDNA测序。是如何做到这样的水平呢？
简约一定不简单！虽只有12个病患，但这些患者是从187例病人中通过了治疗追踪和层层筛选最终获得的“经典样本“，仅生理指标的测评，文中就给出了满满一页的列表……可谓煞费苦心。 研究虽然只是简单的套路和16S测序，也依旧走心的开展了不同组之间差异微生物类群的分析，并结合功能注释进行了微生物与功能的关联。
好科研贵在“走心”，简约却并不简单。这样的”套路“，真的可以学起来呦~
例2：“土豪”无分组研究
相信会有一部分研究者有这样的困扰——大背景研究。想去了解一些特定人群的肠道菌群特征，并没有所谓的实验组与处理组的分别。如此能写出生动的故事来么？
Of course Yes！！不但能，这种大规模作业的形式，还可能发个CNS系列呢！
《Science》此前就发过多篇类似研究，比如荷兰人群的肠道微生态构成和多样性标记研究9。
1179个荷兰人，共收集了1135份样本数据，开展16S和宏基因组测序。相关体质、疾病、用药、生活习惯及饮食特征数据也被做了详实的记录。如此一来，一方面获得了荷兰人群的肠道群落结构和功能特征的信息（下图9）：
另一方面，也挖掘出与人的体质特征等指标相关的一些微生物功能特质（下图），为我们更好的了解人群特征体提供了更深入的视角。
例3：1+1 > 2
人体微生物组研究无数次在强调——微生物组就是人体的第二基因组。
如此一来，研究人就不能只单纯的研究人，还要研究我们的那个“它”。基因组亦然。《mBio》一篇肥胖症患儿的膳食调节菌群研究就是如此10：
一名肥胖症患儿，进行为期105天的膳食调节干预，根据配餐划分为三个干预阶段，分不同时间点取样，研究患儿的肠道菌群宏基因组变化10（下图）。
在宏基因组研究中，发现B. pseudocatenulatum的五个株系在膳食调整过程中产生了响应10（下图）。
如此，研究者对着五个菌株的基因组展开了研究，深入讨论了不同株系的不同响应策略及对人体健康的影响。
人体肠道微生物组测序交叉整合单菌的分离培养和基因组研究，也是医学微生物研究中越来越受关注的一种研究思路呢！伴随而来的培养组研究和微生物制剂开发研究也愈加轰轰烈烈了~
例4：玩儿转多组学（分箱+多组学关联）
多组学关联分析，顾名思义，将多种组学技术整合，深度解析微生物组从群落结构到功能潜力再到功能发挥的全貌。伴随着宏组学技术发展，多组学关联分析的思路也越来越广。 2018年，一篇糖尿病人肠道菌群研究，循着多组学技术的思路，将糖尿病的膳食干预研究推上了《Science》热门11，更成为那个春天的刷屏热帖。
一起来看看这篇文章的几个亮点：
1. 利用宏组学测序手段，深度挖掘了不同处理的病人肠道菌群的结构变化；
2. 引入代谢组研究，重点观测短链脂肪酸水平在膳食干预过程中的变化，深度挖掘微生物组中产生短链脂肪酸的基因构成变化；
3. 更通过宏基因组组装，获得了样本中一些关键细菌的基因组信息，识别了在膳食干预过程中有正向和负向作用的细菌类群（不基于分离培养，Binning组装）；
4. 整合关联，将短链脂肪酸产生菌与膳食干预的代谢变化相关联，深度解析膳食干预的微生物组学机制。
这篇研究中，除了多组学整合，非培养方法获得复杂微生物组样本中单菌基因组信息亦是很多研究者关注的热点。除了使用的binning算法外，Hi-C等基因组技术的应用也能更好的实现组装，并进一步拓展和深化宏组学研究。
例5：动物模型造起来
动物模型在基础医学和临床科研中可谓意义重大——一方面，复杂的人体研究可能存在很多不可控的潜在变量（遗传因素，生活习惯等），通过动物模型可实现整齐划一的处理；另一方面，有一些临床样本非常难得，在这种情况下动物模型可帮助我们更好实现研究取样。
将人体研究与动物模型结合在一起，是进行医学临床科研的绝好思路。
2017年Science报道了口腔细菌在肠道中的异位定殖12，就是循着这样的思路——看一下这篇文章的研究思路和采用的技术手段：
研究剖析了不同患病群体病患肠道中口腔耐氧菌群的分布（下图），并将病人的口腔样本应用于小鼠建模，研究相关促炎因子的变化：
在动物模型研究中，利用组学技术获得肠道内异位定殖的口腔细菌类群（下图左），并开展了单菌基因组测序，深度挖掘相应菌株在免疫过程中发挥的作用（下图右）。
此外结合转录组研究等技术手段，明确目标菌株异位定殖引发炎症反应的诱导机制。
番外：醉翁之意不在“菌”
在一些研究设计中，微生物组研究及技术就并非关注的核心和技术支撑了~
某些研究中，会将微生物组的相关结果可作为表型数据。诸如应用于遗传图谱研究, 来说明遗传背景与微生物群落结构之间的相关性——如下面的两篇关于皮肤微生物组的遗传易感性研究13,14——研究者利用皮肤微生物构成信息作为遗传图谱研究中的表型信息，对构建的家系群体的小鼠进行基因组关联，以探索小鼠基因组信息中有哪些基因可能控制小鼠的皮肤表面微生物构成，并进一步绘制了遗传图谱——严格的讲，这个研究已经“跳出微生物组研究思路，不在此‘套路’，而在彼‘套路’之中了”，也成就了别样的研究“经典”。
从这几个炫酷的设计不难看出，微生物组有很多的花式玩儿法，可化繁为简，可优势整合，亦可出奇制胜~
很多研究者会觉得，微生物组学的技术应用，是广泛的，甚至会开玩笑说是“万金油”的。笔者作为一枚技术，接触过的微生物组研究项目类型真可谓“五花八门”——从热门的“人体第二基因组”到火爆的“植物微生态”研究，从广泛的生物学相关研究应用，拓展到食品工业、药物研究、化妆品领域、境保护检测、建筑工程质量监督……微生物组学的研究应用真的可谓是“跨界网红”，火遍科研圈。
无论怎样的研究，微生物研究的核心内容都是有章可循的，但想要玩儿出花式亮眼的结果，更需要各界关注微生物组学的研究者们结合各自的领域专长，“脑洞大开”的研究设计，让微生物组学研究在各个领域中绽放更多美丽的花朵。
责编：刘永鑫 中科院遗传发育所
版本更新历史
1.0.0，2020/9/3，王晓雯，初稿
1.0.1，2020/9/8，刘永鑫，大修
1.0.2，2020/9/22，刘永鑫，小修
1 Cristina Vilanova & Manuel Porcar. (2016). Are multi-omics enough? Nature Microbiology 1, 16101, doi: https://doi.org/10.1038/nmicrobiol.2016.101
2 Huimin Li, Qi Li, Xin Luo, Jie Fu & Jibiao Zhang. (2020). Responses of the submerged macrophyte Vallisneria natans to a water depth gradient. Science of the Total Environment 701, 134944, doi: https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2019.134944
3 Pablo Fresia, Verónica Antelo, Cecilia Salazar, Matías Giménez, Bruno D’Alessandro, Ebrahim Afshinnekoo, Christopher Mason, Gastón H. Gonnet & Gregorio Iraola. (2019). Urban metagenomics uncover antibiotic resistance reservoirs in coastal beach and sewage waters. Microbiome 7, 35, doi: https://doi.org/10.1186/s40168-019-0648-z
4 Jenni Hultman, Mark P. Waldrop, Rachel Mackelprang, Maude M. David, Jack McFarland, Steven J. Blazewicz, Jennifer Harden, Merritt R. Turetsky, A. David McGuire, Manesh B. Shah, Nathan C. VerBerkmoes, Lang Ho Lee, Kostas Mavrommatis & Janet K. Jansson. (2015). Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature 521, 208-212, doi: https://doi.org/10.1038/nature14238
5 Alexander Crits-Christoph, Spencer Diamond, Cristina N. Butterfield, Brian C. Thomas & Jillian F. Banfield. (2018). Novel soil bacteria possess diverse genes for secondary metabolite biosynthesis. Nature 558, 440-444, doi: https://doi.org/10.1038/s41586-018-0207-y
6 Thibault Stalder, Maximilian O. Press, Shawn Sullivan, Ivan Liachko & Eva M. Top. (2019). Linking the resistome and plasmidome to the microbiome. The ISME Journal 13, 2437-2446, doi: https://doi.org/10.1038/s41396-019-0446-4
7 Yu Deng, Yulin Wang, Yanping Mao & Tong Zhang. (2018). Partnership of Arthrobacter and Pimelobacter in Aerobic Degradation of Sulfadiazine Revealed by Metagenomics Analysis and Isolation. Environmental Science & Technology 52, 2963-2972, doi: https://doi.org/10.1021/acs.est.7b05913
8 Francesca Romana Ponziani, Lorenza Putignani, Francesco Paroni Sterbini, Valentina Petito, Anna Picca, Federica Del Chierico, Sofia Reddel, Riccardo Calvani, Emanuele Marzetti, Maurizio Sanguinetti, Antonio Gasbarrini & Maurizio Pompili. (2018). Influence of hepatitis C virus eradication with direct-acting antivirals on the gut microbiota in patients with cirrhosis. Alimentary Pharmacology and Therapeutics 48, 1301-1311, doi: https://doi.org/10.1111/apt.15004
9 Alexandra Zhernakova, Alexander Kurilshikov, Marc Jan Bonder, Ettje F. Tigchelaar, Melanie Schirmer, Tommi Vatanen, Zlatan Mujagic, Arnau Vich Vila, Gwen Falony, Sara Vieira-Silva, Jun Wang, Floris Imhann, Eelke Brandsma, Soesma A. Jankipersadsing, Marie Joossens, Maria Carmen Cenit, Patrick Deelen, Morris A. Swertz, Rinse K. Weersma, Edith J. M. Feskens, Mihai G. Netea, Dirk Gevers, Daisy Jonkers, Lude Franke, Yurii S. Aulchenko, Curtis Huttenhower, Jeroen Raes, Marten H. Hofker, Ramnik J. Xavier, Cisca Wijmenga & Jingyuan Fu. (2016). Population-based metagenomics analysis reveals markers for gut microbiome composition and diversity. Science 352, 565-569, doi: https://doi.org/10.1126/science.aad3369
10 Guojun Wu, Chenhong Zhang, Huan Wu, Ruirui Wang, Jian Shen, Linghua Wang, Yufeng Zhao, Xiaoyan Pang, Xiaojun Zhang, Liping Zhao & Menghui Zhang. (2017). Genomic Microdiversity of <em>Bifidobacterium pseudocatenulatum</em> Underlying Differential Strain-Level Responses to Dietary Carbohydrate Intervention. mBio 8, e02348-02316, doi: https://doi.org/10.1128/mBio.02348-16
11 Liping Zhao, Feng Zhang, Xiaoying Ding, Guojun Wu, Yan Y. Lam, Xuejiao Wang, Huaqing Fu, Xinhe Xue, Chunhua Lu, Jilin Ma, Lihua Yu, Chengmei Xu, Zhongying Ren, Ying Xu, Songmei Xu, Hongli Shen, Xiuli Zhu, Yu Shi, Qingyun Shen, Weiping Dong, Rui Liu, Yunxia Ling, Yue Zeng, Xingpeng Wang, Qianpeng Zhang, Jing Wang, Linghua Wang, Yanqiu Wu, Benhua Zeng, Hong Wei, Menghui Zhang, Yongde Peng & Chenhong Zhang. (2018). Gut bacteria selectively promoted by dietary fibers alleviate type 2 diabetes. Science 359, 1151-1156, doi: https://doi.org/10.1126/science.aao5774
12 Koji Atarashi, Wataru Suda, Chengwei Luo, Takaaki Kawaguchi, Iori Motoo, Seiko Narushima, Yuya Kiguchi, Keiko Yasuma, Eiichiro Watanabe, Takeshi Tanoue, Christoph A. Thaiss, Mayuko Sato, Kiminori Toyooka, Heba S. Said, Hirokazu Yamagami, Scott A. Rice, Dirk Gevers, Ryan C. Johnson, Julia A. Segre, Kong Chen, Jay K. Kolls, Eran Elinav, Hidetoshi Morita, Ramnik J. Xavier, Masahira Hattori & Kenya Honda. (2017). Ectopic colonization of oral bacteria in the intestine drives T<sub>H</sub>1 cell induction and inflammation. Science 358, 359-365, doi: https://doi.org/10.1126/science.aan4526
13 Meriem Belheouane, Yask Gupta, Sven Künzel, Saleh Ibrahim & John F. Baines. (2017). Improved detection of gene-microbe interactions in the mouse skin microbiota using high-resolution QTL mapping of 16S rRNA transcripts. Microbiome 5, 59, doi: https://doi.org/10.1186/s40168-017-0275-5
14 Girish Srinivas, Steffen Möller, Jun Wang, Sven Künzel, Detlef Zillikens, John F. Baines & Saleh M. Ibrahim. (2013). Genome-wide mapping of gene–microbiota interactions in susceptibility to autoimmune skin blistering. Nature Communications 4, 2462, doi: https://doi.org/10.1038/ncomms3462
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