ISME: 北大吴晓磊组发现囊泡为细菌利用环境血红素提供全新途径
ISME: 北京大学吴晓磊课题组发现囊泡为细菌利用环境血红素提供全新途径
Extracellular heme recycling and sharing across species by novel mycomembrane vesicles of a Gram-positive bacterium
一株革兰氏阳性菌分泌的新型分支酸膜囊泡参与胞外血红素回收与种间共享
Article，2020-10-09
The ISME Journal, [IF 9.18]
DOI：https://doi.org/10.1038/s41396-020-00800-1
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41396-020-00800-1
第一作者：Meng Wang (王蒙)
通讯作者：Yong Nie (聂勇)；Xiao-Lei Wu (吴晓磊)
主要单位：北京大学
College of Engineering, Peking University, 100871 Beijing, China
Institute of Ocean Research, Peking University, 100871 Beijing, China
Institute of Ecology, Peking University, 100871 Beijing, China
摘要
细菌主动分泌的囊泡在其获取胞外营养物质和介导微生物相互作用方面具有重要作用。铁是微生物代谢必需的微量元素，但是自然界中铁源浓度极低，难以轻易获取。该研究中，作者从革兰氏阳性菌Dietzia sp. DQ12-45-1b中发现并命名了一种新型囊泡：分支酸膜囊泡（Mycomembrane vesicles）。在此基础上，研究了该囊泡在回收并共享胞外血红素过程中的作用。研究表明：囊泡可以结合胞外环境中游离血红素和血红素蛋白中的血红素，作为公共物质传递至DQ12-45-1b和其他微生物中促进其生长；而且种间传递和利用的难易程度与细菌物种的亲缘关系相关。由于自然环境中含有大量血红素蛋白，因此本途径的发现可能填补了环境微生物胞外铁源利用的空缺一环。总之，该研究证明囊泡可作为一种全新途径实现胞外血红素结合与获取，并可作为公共物质被整个群落共享。
引言
囊泡是微生物细胞自发分泌的纳米尺度天然脂质体。革兰氏阴性菌囊泡起源自细胞外膜，主要包含外膜组分与周质蛋白；革兰氏阳性菌囊泡起源自细胞内膜，主要成分为内膜蛋白与胞内蛋白。囊泡中包裹的多种活性物质介导其在体外实现多种功能，从而增强细胞对环境扰动的适应性。例如，E. coli可通过囊泡分泌错误折叠蛋白，实现周质压力的释放并提高细胞存活率；Fibrobacter succinogenes囊泡中含有的多种纤维素水解酶可协助细胞实现体外不可溶底物的初步水解；Moraxella catarrhalis囊泡中包裹的毒力因子蛋白可协助细菌抑制宿主免疫反应，增加侵染效率。此外，囊泡还可通过膜融合方式介导微生物相互作用，通过传递DNA与群体感应物质分别实现潜在的水平基因转移与群落结构调控等功能。
然而，前述的囊泡功能研究多集中在革兰氏阴性菌，关于革兰氏阳性菌囊泡功能的研究极少，仅局限在部分致病菌中。最近研究表明，部分特殊的革兰氏阳性菌含有独特的细胞壁结构：除肽聚糖外，该类物种中还含有外侧连接的阿拉伯半乳聚糖以及分支酸结构基础的分支酸膜。其中典型物种为结核分枝杆菌和谷氨酸棒杆菌。值得注意的是，上述这种含有分支酸膜的细菌是否分泌对应的囊泡，及其相应功能是未知的。
微生物为适应低铁环境，进化出了多种策略实现胞外铁源获取。典型如分泌铁载体实现大尺度铁离子结合与回收。除了铁离子外，环境中还含有大量被忽视的血红素铁源，例如在天然生物被膜中、水环境中、土壤中均可检出血红素分子与血红素蛋白。此外，大量的血红素也被作为催化剂应用于污染土壤的生物修复中。但是，微生物是否以及如何回收利用上述血红素铁源还缺少研究。为此，该研究选取含有分支酸膜的Dietzia sp. DQ12-45-1b为出发菌株，研究分析了其囊泡的物质构成及其在回收胞外血红素中的作用。研究结果表明囊泡可实现血红素的结合与回收，并且在群落内共享血红素过程中具有重要作用。
结果
• DQ12-45-1b在低铁条件下分泌分支酸膜囊泡
The Gram-positive bacterium DQ12-45-1b releases mycomembrane vesicles under iron-limiting conditions
为研究分析DQ12-45-1b是否在低铁条件下分泌囊泡，作者将细胞培养至对数末期，利用透射电镜观测到细胞表面的囊泡样突起。进一步在培养基中分离得到了囊泡结构，证明DQ12-45-1b可以分泌囊泡。为深入研究囊泡的结构与起源，通过超薄切片观测发现囊泡直接与细胞分支酸膜连接。此外，脂成分分析发现囊泡中仅含有外膜独有的分支酸（图1）。因此上述结果证明DQ12-45-1b分泌分支酸膜囊泡，是一种全新结构的囊泡类型。
图1. DQ12-45-1b分泌外膜囊泡。（A）对数末期DQ12-45-1b细胞形态；（B）DQ12-45-1b细胞超薄切片观测；（C）DQ12-45-1b囊泡负染观测；（D）DQ12-45-1b细胞与囊泡脂成分分析。MA，分支酸；TDM/TMM，海藻糖分支酸酯；PLs，磷脂。
为进一步分析囊泡蛋白构成，作者分别提取低铁条件与高铁条件下囊泡，并完成了比较蛋白组分析。研究发现两种情况下囊泡蛋白构成类似，均有55%以上蛋白注释为分支酸膜蛋白，进一步证明了囊泡起源自分支酸膜（图2）。同时，研究发现低铁条件下囊泡产量为高铁条件的3倍，因此作者推测低铁条件下过量分泌的囊泡可能具有对应的潜在功能。
• 囊泡中的新型血红素结合蛋白DtHtaA
Novel heme-binding protein DtHtaA: annotation and functions
为研究低铁条件下，DQ12-45-1b囊泡的特定功能，作者完成了不同铁浓度下囊泡蛋白组功能注释与分析。研究发现，97%以上蛋白可被归纳为12类功能，其中丰度最高的集中在细胞壁/细胞膜合成、糖转运、功能未知与无机离子转运方面（83%，图2）。进一步分析发现无机离子转运聚类中，血红素结合蛋白DtHtaA在低铁条件上调50倍，蛋白丰度占比达到4.2%。因此作者推测低铁条件下过量分泌的囊泡可能具有胞外血红素结合功能。随后作者分析测定了DtHtaA的血红素结合活性。通过将异源纯化的蛋白与血红素温育后，在410 nm检出吸收峰，证明了DtHtaA的结合活性（图3）。
图2. DQ12-45-1b囊泡的比较蛋白组分析。（A）囊泡中蛋白的亚细胞定位及其丰度；（B）囊泡中蛋白的COG功能注释及丰度分布。
• 囊泡介导胞外血红素结合与传递
mMVs acts as vehicles of DtHtaA to deliver and transport heme into DQ12-45-1b
进一步地，作者研究了含有DtHtaA的囊泡是否具有血红素结合活性。通过将血红素温育的囊泡作为唯一铁源培养DQ12-45-1b并检测菌株生长情况，证明囊泡可实现胞外血红素的结合与传递（图3）。对应地，ΔDthtaA突变菌株囊泡无法实现上述功能，表明囊泡中的DtHtaA是介导血红素传递的关键物质。考虑到除血红素分子外，环境中还有大量血红素蛋白，因此作者完成囊泡与多种血红素蛋白温育后，将囊泡作为唯一铁源培养DQ12-45-1b并检测菌株生长情况。结果表明囊泡可竞争性获取非共价结合的血红素分子，并将其传递至细胞中。最后，为研究囊泡介导的血红素吸收过程，作者分别敲除了细胞表面血红素结合蛋白基因DthtaA与细胞内膜血红素转运蛋白基因DthmuUV，并以血红素温育的囊泡作为唯一铁源检测血红素吸收情况。结果表明，细胞中的DtHtaA并不参与囊泡血红素的转运，而DtHmuUV虽然参与了囊泡血红素转运，却并非唯一转运途径（图3）。
图3. 囊泡中的DtHtaA参与了胞外血红素结合与传递。（A）DtHtaA蛋白可结合游离血红素分子；（B）囊泡中的DtHtaA是介导血红素结合与传递的关键因子；（C）囊泡可结合并传递血红素蛋白中的血红素分子；（D）细胞中的DtHmuUV参与了囊泡血红素的部分转运。
• 囊泡介导的种间血红素传递
Interspecific mMV delivery
囊泡可在胞外结合血红素，结合后的囊泡在群落中的去向需要进一步解析。为阐述上述问题，作者将血红素温育的囊泡作为唯一铁源培养13种细菌，通过生长情况测定，得出了囊泡介导的血红素传递效率（图4）。作者进一步发现血红素传递效率与物种与DQ12-45-1b亲缘关系有关，亲缘关系越近，传铁效率越高。此外，作者通过研究囊泡与受体细胞的膜融合效率，尝试解析了囊泡传铁机制。研究发现，囊泡与受体细胞的膜融合效率越高，则传铁效率越高，受体细胞生长情况越好。最后，作者发现膜融合效率与物种亲缘关系也存在一定相关性（图4）。
图4. DQ12-45-1b囊泡可介导种间血红素传递。（A）囊泡介导血红素传递至多菌株中。传铁效率与物种与DQ12-45-1b的亲缘关系、囊泡与受体细胞的膜融合效率有关；（B）传铁效率、亲缘关系、膜融合效率拟合分析。
完成上述检测分析后，作者归纳总结了DQ12-45-1b囊泡介导的胞外血红素获取与传递规律（图5）。在低铁条件下，DQ12-45-1b过量分泌含有DtHtaA的囊泡，囊泡随后在胞外实现血红素结合。结合血红素后，囊泡有三种潜在的去向：（1）通过膜融合的方式，被DQ12-45-1b回收利用，经DtHmuUV或其他途径转运至胞内；（2）被亲缘关系较近的物种，以膜融合的方式吸收利用；（3）少数囊泡血红素可被群落中亲缘关系较远的物种利用。
图5. DQ12-45-1b囊泡介导的胞外血红素获取与共享
讨论
该研究首次报道并命名了一种新结构囊泡：分支酸膜囊泡（Mycomembrane vesicles）。在低铁条件下，DQ12-45-1b过量分泌含有DtHtaA的囊泡，囊泡可在体外完成多种血红素分子的结合与转运。因此，除了已知的细胞表面血红素结合蛋白外，该研究报道了一种全新的基于囊泡的体外血红素分子获取与转运。由于自然环境中含有大量血红素蛋白，因此本途径的发现可能填补了环境微生物胞外铁源利用的空缺一环。最后，作者分析发现囊泡中的血红素可被多物种共享利用，且种间亲缘关系与膜融合效率决定了上述过程，因此，这种“亲缘优先”的共享规律可视为一种维持群落结构稳定性的新模式。
参考文献
Wang, M., Nie, Y. & Wu, X-L. Extracellular heme recycling and sharing across species by novel mycomembrane vesicles of a Gram-positive bacterium. ISME J (2020). https://doi.org/10.1038/s41396-020-00800-1
作者简介
第一作者:
王蒙，北京大学工学院博士研究生，主要关注石油微生物囊泡结构与性质、特殊功能及其调控与合成机制等。目前以第一作者发表1篇The ISME Journal，1篇Environmental Microbiology，1篇Frontiers in Microbiology.
通讯作者：
聂勇，北京大学工学院助理研究员。主要关注烃代谢分子调控、微生物相互作用以及微生物群落构建机理。已在The ISME Journal, Environmental Microbiology, Applied and Environmental Microbiology, Molecular Microbiology等杂志上发表论文50余篇。
吴晓磊，北京大学工学院教授，博士生导师，教育部长江学者特聘教授，杰出青年基金获得者。长期从事环境微生物群落结构分析与定向调控，环境微生物资源开发与污染治理与环境修复，污水治理与资源化，微生物采油等理论和技术的研究、开发和应用。已在Nature communications, The ISME Journal, Environmental Microbiology, Applied and Environmental Microbiology, Molecular Microbiology等杂志上发表论文160余篇。
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