MPB：中科院深圳先进院戴磊组小鼠粪便样本中16S拷贝数的定量检测

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小鼠粪便样本中16S拷贝数的定量检测

Quantitative Analysis of 16S rRNA Gene Copies in Mouse Fecal Sample

刘红宾^1*，吕青青¹，戴磊¹

1.中国科学院深圳先进技术研究院，深圳，广东省

*通讯作者邮箱：[e-mail]

摘要：16S rRNA基因和宏基因组测序技术是研究肠道菌群结构与功能的重要手段，由此可以获取微生物群落的结构和功能组成信息；然而，二者得到的数据均为相对丰度类型，大大削弱了不同样品间的可比性，也难以揭示生物量水平的菌群结构和功能变化。本文旨在运用实时荧光定量PCR技术（Real-time PCR）技术对小鼠粪便中的16S rRNA基因进行定量检测，为准确分析肠道菌群的结构提供技术参考。

关键词：16S rRNA基因，绝对定量，肠道菌群

材料与试剂

试剂：

1.高保真酶（PrimeSTAR，TAKARA，R045A）

2.TB Green酶（TAKARA，RR820A）

3.Omega胶回收试剂盒（Omega，D2500-01）

4.琼脂糖

5.引物（27F-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1541R-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA ；331F-TCCTACGGGAGGCAGCAGT，797R-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT）[1]

仪器设备

1.Nanodrop 2000

2.电泳仪

3.普通PCR仪（Bio-read）

4.荧光定量PCR仪（Bio-read）

实验步骤

A.全长16S rRNA基因标准品制备

1.全长16S rRNA基因扩增

PCR扩增体系：

试剂	浓度	体积 （μl）
PrimerSTAR	-	25
27F	2 μM	5
1541R	2 μM	5
小鼠粪便DNA	60-80 ng/μl	1
ddH2O		14

PCR扩增程序（30个循环）：

98 °C	5 min
98 °C	10 s
55 °C	15 s
72 °C	15 s
12 °C	∞

2.全长16S rRNA基因扩增产物回收

按照胶回收试剂盒说明书，对PCR扩增产物进行回收，并利用Nanodrop对其浓度进行测定。

3.全长16S rRNA基因扩增产物拷贝数确定

举例：Nanodrop测得胶回收的16S片段的浓度为182 ng/μl，由于1,500 bp的16S核酸的分子量为5.1 x 10⁵ ng/nmol（https://www.genscript.com/conversion.html），所以标准品中含有3.57 x 10^-4 nmol分子，根据阿伏伽德罗常数计算1 μl标准品中含有2.14 x 10¹¹个拷贝。

4.全长16S rRNA基因扩增产物梯度稀释

将标准品做10倍系列稀释, 使其形成10⁹-10⁴拷贝/μl。

B.16S rRNA基因拷贝数标准曲线的制备

1.全长16S rRNA基因梯度拷贝数标准品的定量PCR检测

Real-time PCR扩增体系：

试剂	浓度	体积 （μl）
TB Green 酶	-	10
331F	4 μM	1
797R	4 μM	1
全长16S rRNA 基因DNA标准品	梯度浓度	1
ddH2O		7

PCR扩增程序（40个循环）：

98 °C	3 min
98 °C	5 s
55 °C	30 s
+ Plant Read
72 °C	30 s
Melt curve 65 °C to 95 °C, increment 0.5 °C for 0:05 + Plate Read
12 °C	∞

2.构建16S rRNA基因梯度拷贝数标准曲线

以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标, 以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数（Ct）为纵坐标得到标准曲线, 为待测样品的定量提供了定量检测的参照标准.

C.小鼠粪便DNA待测样品中16S rRNA基因拷贝数的定量检测

对小鼠粪便DNA待测样品，按照“全长16S rRNA基因梯度拷贝数标准品的定量PCR检测”中的程序与条件，进行real-time PCR检测。依据建立的标准曲线，计算出待测样品中的16S rRNA基因拷贝数。

结果与分析

下图1展示了溶解曲线、标准曲线和待测样品的检测结果。依据标准曲线方程，Ct值为8的小鼠粪便DNA样品中含有的16S rRNA基因拷贝数为10^（-0.2819 x 8 + 10.682）= 2.67 × 10⁸个。

图1. RT-PCR方法检测粪便样本中微生物16S rRNA基因拷贝数熔解曲线和标准曲线

参考文献

1.Jian, C., Luukkonen, P., Yki-Jarvinen, H., Salonen, A. and Korpela, K. (2020). Quantitative PCR provides a simple and accessible method for quantitative microbiota profiling. PLoS One 15(1): e0227285.

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