TiM综述：低微生物量微生物组研究中的污染：问题和建议
The following article is from 水生态健康 Author AEHG
【论文题目】 Contaminationin low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations
【期刊名称】 Trends in Microbiology, 2019, 27:105-117
【全文链接】 https://doi.org/10.1016/j.tim.2018.11.003
【第一作者】 Raphael Eisenhofer
【通讯作者】 Raphael Eisenhofer
【作者单位】澳大利亚阿德莱德大学
亮点
1. 宏基因组学技术具有高度灵敏性，可以检测污染物DNA（来自除研究样品以外来源的DNA）和交叉污染（样品间DNA的交换）。
2. 最近的研究表明，污染物DNA和交叉污染会影响宏基因组学研究，特别是对微生物量较低的样品类型。
3. 该领域迫切需要采用验证标准，以避免宏基因组学研究成为污染物DNA和交叉污染的陷阱。
摘要
微生物组研究中的下一代测序方法使微生物群落、基因组及功能的调查研究比以往任何时候都具有更高的灵敏度。但是，这种敏感性是一把双刃剑，因为这些工具还可以有效地检测污染物DNA和交叉污染，这可能会使微生物组数据的解释产生混乱。因此，迫切需要将关键控制措施整合到微生物组研究中，以提高微生物组研究的完整性和可重复性。在这里，我们回顾了微生物组研究中污染物DNA和交叉污染是如何产生的，并讨论了它们的负面影响，尤其是在分析低微生物量样品的过程中。然后，我们确定了研究人员可以采取的几种关键措施，以减少微生物组研究期间污染物DNA和交叉污染的影响。我们提出了一套最低限度的实验标准“RIDE”清单，以提高未来低微生物量微生物组研究的有效性。
微生物组研究的前景和陷阱
2017年人类微生物组项目的完成是微生物组研究的一个重要里程碑。这个研究领域具有对人类疾病创建新疗法的潜力、有利于环境保护、改善农业生产、理解我们祖先的生活方式、以及确定法医案件中罪犯的潜力，且在其他许多领域也有所贡献。
基于靶向可变区（例如16S rRNA基因的PCR扩增）的扩增子方法之所以被选择作为大多数研究中探索微生物群落的技术，是因为它们速度快、成本低。鸟枪法测序近年来也变得越来越流行，主要是因为其降低了DNA测序成本、且有助于物种水平分类学分辨率和功能基因组信息的获得。两种方法都能迅速检测未培养的微生物，并使研究人员能够比较和对比各种环境中的微生物群落，包括人体、冰川下的南极湖泊、NASA太空设备、深海热液喷口、灭绝的原始人和珊瑚礁。
尽管它们各自都有优点，但用于研究微生物群落的分子方法仍存在局限性，包括非比例靶向扩增和污染物的掺入。尽管已经开发出解决非比例靶向扩增的工具，但限制污染的策略方法却鲜为人知。多项研究记录了污染物的常规扩增及其对生物学解释的影响，但仍然没有系统的要求来检查或报道微生物群或微生物组（以下称为微生物组）研究中的污染。我们在这里强调污染如何对微生物组研究产生负面影响，尤其是在评估低微生物量样品时，并提供一些建议以最大程度地减少未来研究中的污染影响。
微生物组研究中的污染
微生物组研究可能产生两种主要的污染类型：污染物DNA和交叉污染。尽管在收集和制备样品时要格外小心，但污染物DNA仍可能存在许多来源，包括采样和实验室环境、研究人员、塑料消耗品、核酸提取试剂盒、实验室试剂，包括PCR预混液，以及其他样品和测序运行的交叉污染。迄今为止，多项研究在DNA提取空白对照和无模板空白对照中已鉴定出60多种常见污染物类群（表1，关键表）。例如，Salter等在多个研究的空白对照、实验室和DNA提取方法中共同发现了几种污染物类群。这些广泛存在的污染微生物类群似乎有共同的来源（例如，试剂盒和试剂的生产、实验室人员的共生菌以及实验室环境）。尽管已识别出一些常见的污染微生物，但在DNA提取试剂盒之间、实验室之间、甚至在相同实验室内不同时间之间，污染微生物类群的类型和丰度也会发生变化。
表1 以前从多项研究的阴性对照中鉴定出的微生物类群
表1 (续)
a列出了一项以上研究的阴性对照中已确定的微生物类群。该表中列出的微生物类群会显著影响研究结果，对于这种现象应多加质疑，并应提供证据，即研究人员应证明这种发现不是由于污染造成的。
交叉污染是微生物组样品处理过程中的另一个挑战，包括将原始样品DNA、条形码或扩增子从相邻孔或试管转移到创建的“批次效应”。在整个样品处理过程中，交叉污染可能会发生在多个步骤中：在初始样品处理过程中，DNA样品可能会意外（错误）转移、放置在管或板中，以及在移液过程中或在移开板盖时产生。当不正确的相邻条形码“跳入”样品池或试管时，也会发生条形码交叉污染-这种现象称为“标签交换”。最后，由于条形码测序错误，过去测序运行中残留的扩增子或“索引跳跃”，在某些测序平台上，索引序列与测序序列不匹配，交叉污染也可能发生在测序仪上。总体而言，污染物DNA和交叉污染都是动态变化的，需要始终如一地进行常规检测确认。
受污染影响最大的样品类型
样品中污染物DNA和交叉污染的影响会因微生物量水平而异。通过将样品中微生物DNA的量（例如，16S rRNA扩增子的定量PCR）与DNA提取空白对照中的微生物DNA量进行比较，可以估算样品中的微生物生物量。通常含有生物量较高的微生物样品包括粪便和土壤，并且含有比DNA提取空白对照多得多的DNA，而低生物量的微生物样品可能包含与DNA提取空白对照相似水平的DNA，其中包括冰川、空气、岩石、建筑环境、胎盘和血液。低生物量的微生物样品中较低水平的微生物DNA容易使污染物DNA和交叉污染（例如，来自同时处理的高生物量样品）超越竞争并主导样品中的生物信号。
污染物DNA如何影响微生物组研究
污染物DNA和交叉污染的数量和组成可能会随时间和位置而变化，在低微生物量样品中产生易于被视为生物学的信号；图1说明了这一概念。许多研究已经描述了污染物的DNA，并证明了其如何曲解结果，包括已发表的低微生物量研究中的结果。例如，基于扩增子和鸟枪法DNA测序，邦氏沙门菌培养物中大于95％的分类学组成在被稀释约至1000个细胞时受到污染。同一作者还发现，婴儿鼻咽拭子根据DNA提取试剂盒的批号聚集在一起，表明在DNA提取过程中引入的污染微生物类群影响了所观察到的生物信息。低微生物量胎盘样品与空白对照、唾液和阴道拭子的比较显示，胎盘样品中的16S rRNA基因序列无法与空白对照区分开。最后，对外周血和粘膜下组织样品的分析表明，基于99％和95％序列相似性水平，分别发现了对应的污染微生物类群。污染微生物DNA和交叉污染的影响不仅限于这些“举报人”研究，而且迄今发表的每项低微生物量研究都有可能受到不同程度的影响。即使空白对照和低微生物量样品可以使用β多样性分析（例如，未加权UniFrac距离的主坐标分析PCoA图）来区分，由于微生物DNA的污染，在微生物组研究中，α多样性（样品内）和差异丰度的测量值可能被混淆，其主要是受到污染微生物DNA和交叉污染的影响。总之，这些发现表明，污染微生物DNA和交叉污染可能对低微生物量的微生物组研究产生严重影响，如果不加以解决，将继续对微生物组研究的完整性构成明显的威胁。
图1 污染微生物DNA如何影响低微生物量微生物组数据的示意图。
两种低微生物量样品处理组（三角形 vs 圆形）实际上没有差异（样品DNA的颜色相同，蓝色和橙色）。然而，由于处理组所处理的日期不同，因此污染微生物DNA的类型和丰度（在这种情况下，红色vs黑色）的差异会影响该信号，从而得出处理组具有不同微生物组成的结论。对策：样品收集/处理的适当随机化将可消除此现象。PCA，主成分分析。
DNA污染已经对微生物组研究领域产生了怎样的影响？
无法适当地控制和评估DNA污染和交叉污染已经导致了一些研究受到争议。例如，最近的一项研究确定了人类胎盘中一个独特的微生物群落，而没有发表适当的对照。产妇血液中细菌DNA的贡献被认为是一个问题，在后续研究中将胎盘样品与空白对照进行比较时，没有发现明显的胎盘微生物群的证据。最近的一项综合评论认为，目前证据不支持人类胎盘具有独特的微生物群的观点。然而，最初发表的研究激发了对“胎盘微生物群”的后续研究；由于缺乏适当的对照，进一步使胎盘具有独特微生物群的观念得以延续。除了胎盘，最近关于其他低微生物量微生物组的研究越来越多，尤其是在临床医学中，包括对脑组织、乳腺组织、乳头抽吸液、子宫内样品和精液。这些研究均未在其研究结果中提及适当的对照或污染微生物DNA和交叉污染的评估。毫不奇怪，这些研究中的每一项研究都从提取试剂盒和分子试剂中鉴定出常见的污染微生物类群和交叉污染，作为影响所观察到的生物信号的微生物类群。此外，这些研究未能使用其方法来确定检测限，这是研究低微生物量群落时至关重要的第一步。虽然这些信号有可能是真实存在的微生物信号，也有可能是由污染微生物DNA引起的，但其他实验应包括以鉴定这种微生物的DNA是否起源于活细胞而不是污染物DNA的研究。总之，这些研究强调了该领域迫切需要识别并遵守最低限度的实验标准，以确保获得有效且可重复的结果。
减轻污染DNA的影响
为了控制低微生物量微生物组研究中的污染DNA和交叉污染，需要采取多种措施来（1）减少所有类型的污染和实验偏差、（2）监测和识别污染物来源、（3）在分析过程中识别并减轻污染DNA和交叉污染的影响。按照研究进行的时间顺序，我们为每种方法提供了建议，并提出了最低标准的指南（RIDE清单列表，Box 1），以帮助研究人员、编辑和评审者管理未来微生物组研究中的污染影响（Box 1）。
（1）减少采样和处理过程中的实验偏差和DNA污染
可以使用样本收集和处理过程中的简单措施来限制污染DNA的引入和交叉污染，从而最大程度地降低其对后续分析的影响（图2）。首先，将样本和处理随机化（即，将来自不同处理的样本一起收集或处理）是一项重要的实验设计，避免了由批次效应或污染DNA的常规变化引起的错误结论（图1）。此外，如有可能，应使用相同的研究人员、试剂、方式、机器和设备来处理特定研究中的所有样品。专门为了避免污染DNA，有几个关键事项需要注意。样品应在最干净的环境中收集（例如，在船内而不是甲板上，或者在防风区域等），并请专业人员应尽可能穿防护服和相关设备以覆盖人们所有裸露出来的接触面（即实验室外套或无尘室服、口罩、发网、袖子和干净的一次性手套）。理想情况下，研究人员还应在隔离、低污染和设备表面用≥3％的次氯酸钠溶液和紫外线辐射处理过的可控环境（例如静止的空气柜或层流罩）中处理样品。样品处理过程中应当使用最低程度污染的试剂、实验室用具和采样设备。因为标有“无DNA”的耗材通常含有降解的微生物DNA，具有硬质表面的消耗品，例如塑料管和移液器，可以使用环氧乙烷处理进行消除DNA污染。并且可以通过针对每种试剂进行优化的紫外线处理，来对试剂进行去污染（即，紫外线辐射会破坏酶的功能）。理想情况下，还应使用物理隔离的工作站来分装储备试剂，一次用完以限制多次取用造成的污染。为了最大程度地减少交叉污染，还需要考虑其他步骤。文库的制备应与DNA提取分开进行，即在的单独空间进行，以最大程度地减少高扩增产物的污染（即PCR前的工作应与PCR后的工作进行物理隔离）。过滤器和移液器也可以帮助减少交叉污染。强烈建议使用非冗余双标签，以防止在测序过程中发生标签交换。同样重要的是，在DNA测序仪中执行建议的NaOCl和清洗维护，因为这可以减少Illumina MiSeq平台运行间出现的交叉污染。
BOX 1：对于作者、审稿人和编辑，“RIDE”最低标准用于执行/审查低微生物微生物组研究
1）报告了用于减少和评估污染贡献的实验设计和方法。
2）包括评估污染物DNA的对照样品。每次样品收集、DNA提取、PCR扩增都必须包括阴性对照（例如，样品空白、DNA提取空白、无DNA模板扩增）。
3）可以通过将生物样品与阴性（空白）对照进行比较来确定污染程度。
4）探索每项研究中的污染微生物类群，并分析报告其对生物样品的影响。
图2 尽量减少低微生物量样品中污染物DNA影响的方法流程图。
在低微生物量微生物组研究中减少实验偏差和避免引入污染物DNA的措施。
最低要求准则：不同样本组或处理方法应随机分组，而不应单独处理。研究人员应戴一次性实验室手套、口罩，并避免皮肤裸露，以减少将污染物DNA引入样品中。尽可能在干净、隔离（独立）的工作环境中使用经过适当灭菌处理的设备和消耗品进行实验操作（例如样品转移、DNA提取、文库制备和测序）。
（2）包括从采样到测序的控制措施
每个分析中都应包括几种类型的对照，以监测（监控）污染物DNA并评估样品之间的交叉污染水平。这些对照包括用于监控污染物DNA背景水平的阴性对照：（i）对空白对照样品进行采集、（ii）DNA提取空白对照样品、（iii）无DNA模板扩增对照样品。另外，两种类型阳性对照（改变细胞或基因组DNA量）可用于确定检测限、并确保交叉污染不会影响研究结果：（iv）DNA提取阳性对照、（v）PCR扩增阳性对照。
阴性对照
至少需要三种类型的阴性对照，以在整个样品处理和加工过程中充分监测污染物，并具有检测何时以及如何将污染物引入生物样品的能力。每次采样、DNA提取和PCR扩增批次必须至少包括各类阴性对照类型中的一种。尽管我们建议应使用两个阴性对照（作为重复），并从实验的开始到结束都应战略性地监控污染物（例如，第一个试管应为阴性对照1号，最后一个试管应为阴性对照2号）。对于使用带有样品板的机器人系统进行的较大规模研究，每个研究中每种阴性对照数量的最低要求为8。
（i）样品采集空白对照。可以检测采样过程中引入的污染物DNA，包括用于收集样品的物品，例如棉签、纱布或取样钻头，以及用于存储或运输样品的任何试剂或防腐剂（例如，培养基、酒精或RNA稳定剂）。在空白样品中分析的材料应与生物样品在同一空间和时间内收集，并应由同一实验室从样品收集到测序进行生物样品处理。尽管采样控制组将包含来自提取过程中的DNA，但它将使研究人员能够识别哪些污染物特定来自于某采样位置、设备或实验室。
（ii）DNA提取空白对照。这些空白对照在DNA提取过程中监测提取试剂盒、分子试剂和实验室环境中污染物DNA的含量，并且如上所述，从提取到测序的过程应与生物样品一起同时处理。
（iii）无DNA模板扩增空白对照。这些可以监测文库制备和测序过程中试剂和实验室环境中存在的污染物DNA。所有阴性对照均提供了背景污染物的半定量估计值，并使研究人员能够识别可用于后续分析中的污染物。最后，应该注意的是，阴性对照可能包含的DNA太少而无法有效处理。在这些情况下，在空白对照中使用已知的载体DNA可以帮助有效扩增污染物。
阳性对照
可以选择两种类型的阳性对照来确定检测限，并深入了解交叉污染对DNA提取、文库制备和测序过程的影响。
（iv）DNA提取阳性对照。这些用于监测DNA提取效率、确定检测限，并检查DNA提取过程中的交叉污染水平。为了一个阳性对照的DNA提取，应与样品一起提取已知细胞类型的连续稀释液（例如1、10、100、1000、10000、100000个细胞）并超出预期的最低检测限。理想情况下，研究人员应使用可商业购买的混合群落，例如Zymo模拟群落（Zymo，D6300），因为这可以实现不同实验室之间的标准化。研究人员还可以考虑在液体样品（例如血液、尿液或粘液）中加入一系列正滴定加标，以评估提取效率和检测限，这很重要，因为许多样品类型都包含可以增加检测限的抑制剂或化学试剂。底线是使用与您的研究和实验问题相关的已知浓度的阳性对照。（iv）PCR扩增阳性对照。这是最后推荐的阳性对照，并且再次包括仅在文库制备阶段中要处理的已知生物类型的DNA。此阳性对照使检测限得以建立，以用于文库制备。至关重要的是，两种阳性对照类型都可以利用生物信息学方法来计算所用实验室技术内的检测限和交叉污染水平。例如，Katharoseq通过计算临界值来利用阳性与阴性对照扩增效率的差异来确定检测限，以指导污染样品的排除。这样做也可以评估交叉污染，因为DNA提取的阳性对照应该不同于文库制备中使用的阳性对照。对照样品通常会产生数量和质量较低的文库，但这不妨碍对照样品的测序。文库应被量化（即使用PicoGreen或Qubit仪器进行扩增子研究，或使用TapeStation或BioAnalyzer进行鸟枪法测序），并以相等的摩尔浓度（例如每个样品中每个观察到的片段长度为X ng）混合。如果PCR扩增后的对照样品所含DNA量明显低于生物样品，则应通过给定的最大体积混合对照样品（例如每个对照20 µl）。此外，扩增的生物样品DNA含量低的样品可以与具有相同最大体积的对照样品（例如20 µl）混合。或者，可以将所有样品和对照样品以等体积混合。然而，这种方法需要更深的测序深度，因为更高生物量的样品将在DNA测序过程中起着主导作用。尽管不是理想的办法，但另一个选择是增加阴性对照的PCR循环数，以获得更多的DNA进行测序。对于有争议的样品类型（例如胎盘），强烈建议您在另一个实验室中进行独立重复实验，以及使用非DNA测序方法（例如荧光原位杂交，FISH）进行验证。
最低要求准则：对于每批样品，必须包括每种类型的阴性对照（样品空白对照，DNA提取空白对照、无DNA模板扩增空白对照）；或者在使用机器人设备进行实验时，每个96孔板至少要包含8个阴性对照。对照组必须与实验组一起（同时）处理以解决污染问题，并且不应单独进行处理。（3）严格评估并报告分析过程中的污染情况
污染微生物类群的影响必须在最终分析和数据解释中进行评估。当前，有三种不同的策略可用来评估污染物的影响。微生物组数据集：（i）将对照样品与生物样品进行比较，（ii）从生物样品中减去污染物，（iii）使用预测模型来确定假定的污染物。每种方法的严格性和适用性各不相同。
（i）生物样品与对照样品的比较可用于评估污染水平和污染微生物类型。污染程度（即微生物DNA污染的背景程度）必须在每批样品中被鉴定，因为污染微生物DNA会随不同的方法和时间而变化。定量PCR（qPCR）可用于通过比较阴性对照相对于生物样品的丰度确定污染程度。另外，建议阳性对照结合检测限方法用于计算样品排除值（例如K1/2值），且序列数少于排除值的样品应丢弃。必须报告在阴性对照中检测到的微生物类群。特别重要的是，要确保样品和处理组微生物类群中的丰度或组成之间存在显著差异，避免受污染微生物类群的影响。我们提供了一个包含在两项或多项研究的阴性对照中检测到的污染微生物类群的名录（表1）。虽然我们不建议研究人员完全丢弃这些微生物类群驱动的重要结果，但研究人员和审稿人应对此类发现尤为谨慎地使用和解释。
（ii）阴性对照中检测到的污染微生物类群也可以在分析过程中从生物样品中去除（过滤）。一种方法是从生物样品中去除阴性对照中发现的所有微生物类群。这种极其保守的方法可能会导致生物信号丢失，例如由于DNA从生物样品到阴性对照中会发生交叉污染。此外，与常见污染微生物类群密切相关的类群可能确实存在于生物样品（例如，假单胞菌）中，但可以通过这种方法将其去除。相反，我们建议使用已开发出的更细微的过滤方法，以帮助解决在交叉污染较高的情况或认为生物样品中存在与常见DNA污染密切相关的微生物类群的情况。最后，如果污染微生物类群在过滤后仍影响生物信号，则应使用其他方法进行验证，例如一种可有效应用和验证的FISH检测方法。
（iii）已经开发了生物信息学模型来评估生物样品中的污染物类群的来源和比例。例如，Source Tracker分析使用贝叶斯模型从数据集中评估潜在污染物类群的比例。为此，空白对照可用作污染物的“来源”，而生物样品则可用作“汇”来评估生物样品中污染物类群的来源和丰度。随后，可以得出样品中污染物DNA的相对贡献，其可用于后续分析和数据的解释。然而，值得强调的是太多的交叉污染会混淆Source Tracker分析。
最低要求准则：必须确定每批实验样品的污染水平。生物样品应与阴性对照进行比较，且在阴性对照中鉴定出的微生物类群必须如实记录。用于识别和最小化污染微生物DNA影响的方法在分析过程中应被清楚地报告，以提高可重复性，并允许其他人对其进行严格评估。
结束语
微生物组研究在多个领域都具有广阔的应用前景，但是方法论上的缺陷很容易破坏这个研究领域的发展和声誉。因此，研究人员、审稿人和编辑必须在科学研究过程中的每个阶段都识别并明确解决这些缺陷问题。我们在这里介绍了污染微生物评估的RIDE清单列表，可应用于对探索低微生物量样品中的微生物群落感兴趣的研究中（RIDE最低标准见Box 1）。不考虑这些警告（告诫），可能会浪费宝贵的时间和金钱，并减弱微生物组研究的信誉。目前的情况与20年前认识到的古DNA研究方法中所存在的问题在许多方面都很相似。基于短序列PCR扩增的一系列论文被用于支持一些研究的重大发现，包括所报道的超过4千万年的DNA回收——远远超出了DNA生存的理论极限（1百万年）。尽管这些发现遭到其他古DNA研究人员的严厉批评，以及现在被认为是错误的，但这些论文却破坏了古DNA领域的信誉。直接的结果是，制定了一套古DNA认证标准，并被广泛应用。这些标准、改进的技术以及对污染微生物DNA问题的更多关注，极大地提高了古DNA研究的可信度。在微生物组研究中，需要建立类似的标准，以提高科学完整性并确保此类研究的可信度。重要的是要注意，我们建议的最低限度的指导原则集和RIDE清单列表（Box 1）不能保证可以解释或消除所有的污染，也不能为每个污染问题提供解决方案。还应考虑使用其他方法来验证结果，例如在其他独立实验室中进行重复验证以及使用非DNA测序技术（例如FISH）进行结果验证。随着微生物组新方法和新分析方法的发展，亟待建立用于解决污染微生物DNA和交叉污染的新解决方案。同时，当务之急是低微生物量研究应产生足够的（阴性、阳性）控制数据，并且研究人员在处理低微生物量微生物组样品时应养成并保持一种重要的批判性思维方式。在这方面，我们希望本文介绍的指南将有助于作者、审稿人和编辑监控和保护微生物组领域的未来。
未解决的问题
1）未来的分子技术能在多大程度上推动低微生物量样品的检测极限？
2）随着宏基因组学研究过渡到鸟枪法宏基因组测序，是否能采用对低微生物量生物体位点进行无偏见探究的宿主DNA方法？
3）分析生物样品时，对阴性对照中发现的污染微生物类群进行差减过滤（去除）的最佳方法是什么？
4）是否可以开发出可靠的分析方法来解决样品之间的交叉污染？
词汇表
Contaminant DNA（污染DNA）：来自研究样品以外来源的DNA（例如来自实验的试剂或研究人员的DNA）。
Contamination（污染）：涵盖了污染DNA和交叉污染的总称（见下文）。
Cross-contamination（交叉污染）：在同一项研究中样品之间的DNA交换（例如，DNA提取期间DNA在不同样品管之间的意外转移）。
DNA extraction blank control（DNA提取阴性对照）：阴性对照包括空的（无样品）管/孔，与生物样品一起进行DNA提取并允许在DNA提取过程中检测引入的污染DNA。
DNA extraction positive control（DNA提取阳性对照）：在DNA提取过程中，阳性对照由已知类型的一系列稀释细胞组成，即其与生物样品一起处理。阳性对照允许确定检测限，检测提取效率和量化DNA提取过程中的交叉污染。
Low microbial biomass samples（低微生物量样品）：与阴性对照相比（例如微生物的细胞小于或等于10000），包含相似数量的目标微生物样品的DNA。
Microbiome（微生物组）：一个特定的栖息地所有微生物，及其基因组和周围环境条件。
Microbiota（微生物菌群）：存在于特定环境中的微生物的集合。
No-template control（无模板对照）：通过准备没有DNA模板（即样品DNA）的PCR扩增或文库制备反应的一个阴性对照，与生物样品一起处理并可以检测文库制备/PCR扩增过程中的污染DNA。
Positive amplification control（阳性扩增对照）：阳性对照，在PCR扩增或文库制备过程中同生物样品一起处理的、一系列稀释的已知生物体DNA组成，允许确定检测限、监测文库制备效率、量化文库制备过程中的交叉污染。
RIDE checklist（RIDE清单列表）：关于方法论的报告，包括对照样品、确定污染的程度、考察污染对后续分析结果的影响，低微生物量微生物组研究的最低标准列表。
Sampling blank control（采样空白对照）：阴性对照，由收集生物样本时进行相同操作处理但不装样品的空管组成。允许检测采样过程中（例如空运、棉签和防腐剂）引入的污染物DNA。
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