NC：电缆细菌减少水稻种植土壤中的甲烷排放
摘要
甲烷是仅次于二氧化碳的第二大温室气体，全球约11%的人为甲烷排放来自稻田。硫酸盐施用是一种减少稻田甲烷排放的减缓战略，因为硫酸盐还原剂和产甲烷菌争夺相同的底物。已知电缆细菌（cable bacteria）是丝状细菌中通过电硫氧化增加硫酸盐水平。我们的研究表明，与没有电缆细菌的对照相比，一次性接种的电缆细菌水稻土壤盆栽可使硫酸盐增加5倍，从而减少甲烷排放93%。因此，通过富集或合理管理来促进稻田电缆细菌，可能因此成为减少人为甲烷排放的一种战略。
研究背景
电缆细菌是脱硫杆菌科家族(Desulfobulbaceae)的丝状细菌，它在海洋和淡水系统中，通过引导电子沿其细丝，在空间上解耦硫化物的氧化和氧气或硝酸盐的还原。这一过程被称为电生硫化物氧化(e-SOX)，其结果是硫化物的耗尽和最终产物硫酸盐的积累。e-SOX释放出的质子使铁硫化物溶解，随后释放出的硫化物被氧化为硫酸盐，从而进一步增加了硫酸盐库。此外，通过e-SOX建立的电场会导致硫酸盐向下迁移，并使其对水柱的损失最小化。因此，电场有助于 e- SOX驱动的硫酸盐积累，最近有研究表明，这可以促进硫酸盐还原。
外界已知，在湿地水稻土壤中使用硫酸铵或石膏等含硫酸盐化合物可以减少甲烷(CH4)排放。这是因为硫酸盐的加入刺激了硫酸盐在其他有限的硫酸盐环境中的还原，从而导致了甲烷生成的底物限制，因为硫酸盐还原微生物是比常见底物如氢和乙酸盐更好的竞争对手。
然而，外源添加的硫酸盐可以迅速转变为硫化物，而硫化物往往会在土壤中积累，这意味着只有重复施用少量的硫酸盐，才能实现对CH4排放的长期影响。在此，我们采用蒸压湿地土壤与牛粪混合进行水稻盆栽试验，接种一种缺乏电缆细菌的复杂微生物群落，一半的盆栽接种淡水电缆细菌Ca. Electronema sp. GS。在水饱和度下培育11周后， 测定了硫酸盐浓度、 CH4排放量、电缆细菌的数量和活性。结果表明，电缆细菌通过 e-SOX 循环硫酸盐，减少水稻土中 CH4的排放。
Fig. 1 Distribution of cable bacteria in rice-vegetated pots. a Depth profifile of the cable bacteria filament densities in inoculated rice soils. Data arepresented as mean ± standard error of the mean (n = 4). b Micrograph of a cable bacteria filament in close contact with a rice root. Image from DAPIstaining (blue) was superimposed with FISH images hybridized with probe DSB706 specifific for Desulfobulbaceae labeled with Cy3 (red) and probe EUBMIX targeting most bacteria labeled with Atto-488 (green). Red arrows point to the cable bacteria fifilament. Scale bar, 20 µm.
结果
1. 电缆细菌分布
培养11周后，水稻植株地上生物量在不同处理间无差异(P= 0.64, n=8，未配对双尾t检验，见补充图1)。荧光原位杂交(FISH)显示接种盆中有400±100 m cm−2电缆菌丝，表明电缆细菌可以成功地转移到无细菌的电缆土壤中并生长到高密度。大多数电缆细菌细胞位于最上面的2厘米处(图1a，补充图2a)。此外，电缆细菌与水稻根系密切接触(图1b，补充图2b)。然而，在土壤上层观察到较高的灯丝密度，表明大部分电缆细菌减少了氧气从水柱扩散到土壤。经过11周的培养后，对照组没有发现电缆菌丝。
Fig. 2 Sulfate concentrations and pH in the rice-vegetated pots. a Sulfate concentrations in the porewater of pots with cable bacteria (top) and in potswithout cable bacteria (bottom). b Depth profifiles of pH measured with microelectrodes in pots with cable bacteria (circles) and without cable bacteria(triangles). Data are presented as mean ± standard error of the mean (n = 4).
2. 硫酸盐和pH值深度剖面
电缆无菌培养和电缆细菌培养的覆盖水相中硫酸盐浓度分别为1646±3和2230±20µM (n=3，技术重复)。在不添加电缆菌的情况下，土壤孔隙水中的硫酸盐浓度在4cm深度从1000±100µM下降到70±20µM，表明水柱向土壤中的硫酸盐扩散减少，深层土壤未发生硫化物氧化反应(图2a)。存在电缆细菌的土壤孔隙水中硫酸盐的含量在4cm 以上(90 ± 20mmol 硫酸盐 m-2)比无电缆的盆栽高5倍(p = 0.006，n = 8，未配对双尾 t 检验) ，硫酸盐含量在4cm 以下(17 ± 2mmol 硫酸盐 m-2)均匀分布，顶部1900 ± 100m 至3-4cm 深度2200 ± 700m (图2a)。实验设计不允许从盆底部3厘米处取回土壤样本，有电缆细菌的盆栽在3 ~ 4 cm深度处的硫酸盐浓度是没有电缆细菌和硫酸盐的盆栽顶部厘米处的两倍，假设硫酸盐的潜在还原速率相似，那么在后者中穿透4厘米就意味着硫酸盐已经渗透到了电缆细菌罐的底部。此外，在电缆细菌改良盆栽中发现 e-SOX的典型疾病潜伏期。7.2 mm深度的pH值降低了0.24个单位(图2b)，土壤表层形成橙色层(补充图1)，这可能是由于铁硫化物的溶解以及随后的铁扩散、氧化和以铁氧化物的形式沉淀所致。硫化铁溶解产生的硫化物被e-SOX氧化为硫酸盐，很可能是电缆细菌盆栽中硫酸盐总量的组成部分。
Fig. 3 CH4 emissions. The emitted amount of CH4 from replicate rice potswith cable bacteria (circles) and without cable bacteria (triangles)normalized to the surface area of the pots as a function of time.
3. 甲烷排放
根据培养系统中 CH4浓度的线性增加计算出盆中 CH4的排放速率(图3)。有电缆细菌的盆栽中CH4排放量明显低于无电缆细菌的盆栽中CH4排放量(p = 0.006，n = 8，未配对双尾 t 检验)。因此，电缆细菌的存在可以减少93%CH4甲烷的排放。
Fig. 4 Potential microbial-mediated processes.In rice-vegetated soilswithout cable bacteria (left) and with cable bacteria (right) organic carbon(Corg), e.g. from root exudation, is degraded by a consortium ofmicroorganisms to acetate and hydrogen, which are the main substrates formethanogens.
讨论
与加入硫酸盐的研究相比，电缆细菌介导的 CH4排放减少93% 是报道中最高的还原效率之一。实验中的主要控制因素可能是硫酸盐的富集，这些富集物均匀地分布在盆中4cm 的上部，这表明硫酸盐还原通过e-SOX的硫再氧化来平衡，并最终离子迁移增加了硫酸盐的运输。硫酸盐的积累刺激了硫酸盐还原菌的活性，从而超过产甲烷菌对常见底物如氢或醋酸盐的竞争。这些基质来自于根分泌物和根系脱落物质中的有机碳供给的传导过程。此外，我们选择蒸压湿地土壤作为通用基质来检验我们的假设。我们在湿地土壤中添加了牛粪，以提供由发酵剂、产甲烷菌和硫酸盐还原菌等复杂微生物群落组成的接种物，但没有电缆细菌，这也增加了我们实验开始时盆栽中的有机碳库。除增加硫酸盐外，e-SOX还产生酸度。PH值的微观剖面只取到7.2mm的深度，以减小传感器与根部碰撞的风险，避免传感器断裂。然而，之前已经有研究表明，e-SOX产生的酸度甚至可以降低到4cm。低pH值阻碍发酵过程和产甲烷，导致甲烷排放减少。例如，据报道，pH值从pH 6.9到6.8会使淹水水稻土壤中CH4的产量减少26%。综上所述，e-SOX的多种影响，即硫酸盐积累和pH值下降，可以解释对CH4排放的强烈影响(图4)。相比之下，作为缓解战略的硫酸盐修正案对ch4排放的影响在实施后减弱，即使在11周的培养后，电缆细菌介导的硫酸盐积累仍通过e-SOX积极维持。此外，硫酸盐的外部添加物可能导致有毒硫化物浓度的增加，而硫酸盐则可能通过提供硫酸盐作为营养物质而阻止有毒硫化物浓度的增加，甚至可能通过提供硫酸盐作为营养物来促进植物性能。
一次性接种后电缆细菌建立成功，菌丝密度在典型的电缆细菌丰度范围内。在根系上也发现了电缆细菌，这与之前的研究报道电缆细菌在释氧植物的根系上富集是一致的。事实上，水稻根系可以释放氧气——为电缆细菌提供电子受体。因此，湿地稻田可能是电缆细菌的理想栖息地。我们发现出现的问题在多大程度上电缆细菌生长在湿地的稻田和是否可以提升他们的存在的一次性与电缆细菌接种水稻种植期的开始,通过调整水位,以保证上面的土层中含氧培养期。
实验方法
1. 植物的生长
水稻幼苗在自来水中发芽，在市购的花园土壤中在排水条件下生长到三叶期。湿地土壤于2019年4月在丹麦奥尔胡斯(56°09′53.32N, 10°12′28.73E)的一个小富营养化湖泊中提取，经筛选、蒸压处理。新收集的牛粪与蒸压土壤混合。然后在土壤-牛粪混合物(≈1500:1,v/v)中加入电弧菌(Ca. Electronema sp. gs9)的电缆细菌富集培养物，接种电缆细菌。仔细均匀化土壤后，填入生长盆(深度:7cm;直径:12cm)，每盆土壤的前2cm再接种电缆细菌富集培养物(≈225:1,v/v)，仔细均质。插秧后，每个处理4个重复置于加气自来水培养槽中。通过避免两个培养槽之间的直接接触，排除了交叉污染。水位持续保持在土壤表面以上，最高可达几厘米。这些植物在室温和窗边自然光照条件下生长了11周，前几周增加了额外的光照。采样后，收集每株水稻的地上生物量，在80°C下干燥44 h，测定干重。
2. 微电极测量
在11周的培育期后，用定制的微传感器和一个市购的参比电极(Red Rod参比电极，REF201, Radiometer Analytical，丹麦)记录pH的深度曲线。软件SensorTrace Pro (Unisense A/S，丹麦)用于操作微操作器和进行数据采集。pH传感器在pH值为4、7和10的缓冲液中进行校准(HANNA仪器，英国)，并在MS Excel (Microsoft Corporation, United States)中校正每个剖面的深度。
3.CH4测量
在进行微电极测量后，将花盆从水箱中取出，并小心地移走土壤表面的任何残余水。盆栽被放置在一个定制的不透明的PVC腔内(内部尺寸:91厘米高，14厘米直径)，顶部有一个橡胶隔片，培养2.5天。500µL的顶空样品用注射器抽取，直接注入配备火焰电离检测器的气相色谱仪(310 C, SRI Instruments, United States)。
4.硫酸盐和FISH分析
每个盆栽取一个内径为4.5厘米的土芯，并切成4个1厘米宽的断面。对于硫酸盐的测定，每个深度的孔水通过离心从固相分离，用0.22µm过滤，6℃保存，用AG18 Guard柱(美国Dionex公司)和Dionex IonPac AS18柱(美国Thermo Fisher Scientific公司)进行离子色谱分析。运行时间为18分钟，硫酸盐洗脱时间为9.5分钟。用于FISH分析，每段0.5 mL土壤与0.5 mL乙醇混合，在−20℃保存。取芯后，用剪刀从剩余的土壤中剪出根切片，储存，用50%的乙醇洗涤，干燥并在井载玻片上装入0.5%的琼脂糖。如前所述，用FISH染色并定量电缆细菌丝。
5.统计分析
结果显示为平均值±s.e.m.四个生物学重复，除非在文本中有不同的说明。采用无配对双尾Student’st检验(显著性水平为0.05,8个观测值和6个自由度)，测定了水稻上生物量、CH4排放率和深度综合硫酸盐浓度的差异。实验设计如图3所示。
参考文献
Scholz, Vincent V.; Meckenstock, Rainer U.; Nielsen, Lars Peter; Risgaard-Petersen, Nils (2020). Cable bacteria reduce methane emissions from rice-vegetated soils. Nature Communications, 11(1), 1878–. doi:10.1038/s41467-020-15812-w
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