环境DNA高通量测序问题及解决SOP (Part 1: From sample to data)

高通量测序技术是对传统测序的革命性改变，基于扩增子的高通量DNA测序方法是目前国际上微生物群落研究中最方便、最经济、最有效的常规方法之一。然而不同研究会产生不同的结果，这通常是基于DNA序列的微生物组学研究在不同阶段引入的系统性偏差导致的。根据样品来源和采集方法不同，样品采集时可能会产生偏差；在选择储存方式、时间和试剂时必须保证方法一致；增加基准样品和技术重复也有助于降低样品收集和处理过程中产生的批次效应。在DNA提取过程中，由于提取效率不同、污染和从死亡生物中引入DNA，会产生偏差；采用合理措施减少污染、分析样品板间和批次间变异度有助于消除这些偏差。最后，考虑到PCR扩增、测序和生物信息学分析过程中引入的额外偏差，对于揭示样品中微生物群落的真实情况至关重要。使用规范、标准一致的方法可以减少偏差，并且有助于提高结果的可重复性。

水生态健康研究组（杨军团队）从2011年开始学习微生物高通量测序技术，通过对环境样品中细菌16S rRNA基因、真核生物18S rRNA基因或ITS序列进行PCR扩增、建库测序，最后进行序列分析。

经过10年坚持不懈的努力、水生态健康研究组掌握了从采样到实验、从记录到分析等一系列技术方法，建立了样品库、数据库、档案库。截至2021年初，研究组已经测序完成样品13000份。

然而，实际上在工作中经历过多次失败、遇到过多次困惑，也走过多次弯路，因此有必要对经验教训进行总结，形成SOP。本SOP基于研究组多年的实际经历和体会，以水体微生物为例，梳理总结了样品采集、DNA提取、建库测序、生信分析和数据报告等方面的流程细节问题、解决方案和经验教训。不求全，只求通，力求将关键步骤讲透。供同行新手、新生在实验设计和档案管理时参考。 

参考文献：

1. Yang CY, Bohmann K, Wang XY, Cai W, Wales N, Ding  ZL, Gopalakrishnan S, Yu DW. 2021. Biodiversity Soup II: A bulk-sample metabarcoding pipeline emphasizing error reduction. Methods in Ecology and Evolution in press

2. Nearing JT, Comeau AM, Langille MGI. 2021. Identifying biases and their potential solutions in human microbiome studies. Microbiome 9:113

3. Liu LM, Chen HH, Liu M, Yang JR, Xiao P, Wilkinson DM, Yang J*. 2019. Response of the eukaryotic plankton community to the cyanobacterial biomass cycle over 6 years in two subtropical reservoirs. The ISME Journal 13:2196–2208

4. Liu M, Xue YY, Yang J*. 2019. Rare plankton subcommunities are far more affected by DNA extraction kits than abundant plankton. Frontiers in Microbiology 10: 454

5. Xue YY, Chen HH, Yang JR, Liu M, Huang BQ, Yang J*. 2018. Distinct patterns and processes of abundant and rare eukaryotic plankton communities following a reservoir cyanobacterial bloom. The ISME Journal 12:2263–2277

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7. Costea P, Zeller G, Sunagawa S et al. 2017. Towards standards for human fecal sample processing in metagenomic studies. Nature Biotechnology 35:1069–1076

8. Sinha R, Abu-Ali G, Vogtmann E et al. 2017. Assessment of variation in microbial community amplicon sequencing by the Microbiome Quality Control (MBQC) project consortium. Nature Biotechnology 35:1077–1086

9. Liu LM, Liu M, Wilkinson DM, Chen HH, Yu XQ, Yang J*. 2017. DNA metabarcoding reveals that 200 μm size-fractionated filtering is unable to discriminate between planktonic microbial and large eukaryotes. Molecular Ecology Resources 17: 991–1002

10. Liu LM, Yang J*, Yu Z, Wilkinson DM. 2015. The biogeography of abundant and rare bacterioplankton in the lakes and reservoirs of China. The ISME Journal  9:2068–2077

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编辑：续子杰、任可欣

审核：杨军

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