Science︱突破！正常和畸形人脑血管系统的单细胞图谱

撰文︱郑媛嘉

责编︱王思珍

脑血管系统由一个连续的树枝状的循环的血管导管网络组成，可确保氧气、能量代谢物和营养物质输送到大脑，并清除大脑的代谢产物，防止毒素的进入。脑血管系统在功能上分为动脉、小动脉、毛细血管、小静脉和静脉等。每条脑血管由内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞（smooth muscle cells，SMCs）、血管周成纤维细胞样细胞（简称血管周成纤维细胞）组成[1-3]。血管细胞与周围神经元、胶质细胞和血管周免疫细胞之间协调的分子相互作用，使脑血管具有特定的属性。小鼠的单细胞mRNA测序（single-cell mRNA sequencing，scRNA-seq）提示了某些细胞变异，并为“分带（zonations）”的动静脉表型改变提供了分子基础[3]。但目前，现有的人类脑细胞图谱未有涉及脑血管系统，很多神经系统疾病如中风、阿尔茨海默病、或者大脑衰老等与特定动静脉节段有密切的联系[4]。因此，人类脑血管系统的大规模单细胞图谱将会提供参考，以便更好地理解在人类脑血管疾病中选择性细胞脆弱性和异常基因表达模式的分子基础。

2022年1月27日，美国加州大学旧金山分校神经外科的Tomasz J. Nowakowski、Daniel A. Lim、Adib A. Abla课题组合作在Science上发表了（published online ahead of print）题为“A single-cell atlas of the normal and malformed human brain vasculature”的文章。作者分析了181388个细胞的转录组，阐明了靶向血管畸形中的血管生成和炎症程序中的血管和免疫细胞之间的相互作用。

研究团队对癫痫患者进行了脑叶切除术，并获得了正常的大脑皮层组织并显微分离较小的血管（小动脉、毛细血管和小静脉）[6-8]（图1 A），随后进行scRNA-seq，从5个个体的74535个细胞中生成高质量的转录组数据。鉴定出了主要的血管细胞类型有：内皮细胞（CLDN5）、周细胞（KCNJ8）、SMCs（MYH11）和血管周成纤维细胞（DCN）（图1 B-C）[3,9-10]。然后利用多重空间转录组学对成人大脑皮层的血管细胞多样性进行了空间解析（图2）。脑血管细胞亚群聚集在各类血管细胞结构中，如动脉、毛细血管和静脉（图2 D）。综合空间转录组学与从scRNAseq鉴定的细胞亚群的信息可以鉴定出脑血管主要分支的细胞类别。

图1 人类脑血管系统的细胞分型

（图源：Ethan A. Winkler, et al., Science, 2022）

内皮细胞（CLDN5⁺，PECAM1⁺）主要由六个亚群组成（图1 E-F）。对比先前注释的小鼠内皮细胞图谱发现，该六个亚群对应于四个动静脉段（动脉、毛细血管、小静脉和静脉）的基因表达特征[5]（图1 G），还发现了动脉分带内的包括基因TXNIP富集在内的三组内皮细胞亚型（图1 E-F），TXNIP编码一种葡萄糖代谢和氧化应激的调节因子[11]，这可能代表了动脉内皮细胞的代谢状态。作者也确定了VEGFC⁺、MFSD2A⁺和ACKR1⁺内皮细胞在动脉、毛细血管和静脉中的位置（图2 D）[3-5]。周细胞存在于毛细血管、小静脉和一些小动脉中，并诱导和维持血脑屏障[6]。这里作者提出一种新的标记物来捕获更多周细胞：HIGD1B。HIGD1B mRNA在91.7%的周细胞中检测到（图1 I），也在PDGFRB⁺或KCNJ8⁺周细胞中的表达（图2 B-C）。SMCs是动脉、静脉和大多数小动脉中的收缩细胞[3]，根据标记物CNN1、TAGLN和MYH11可区分这些细胞（图1 C，I）。这些细胞亚群可能存在额外的变异（图1 H-I），比如这些细胞富集了可调节SMC增殖和迁移的金属硫蛋白编码基因MT1X、MT2A、MT1M、MT1E和MT1A [12]，可协调大脑对全身感染的反应的血管周围细胞趋化因子配体基因CCL2[13]，以及可调节鞘氨酰胺1-磷酸信号与SMC增殖的RGS16  [14]。成纤维细胞松散地粘附在血管周围的动脉、小动脉、小静脉和静脉上，表达细胞外基质蛋白，并支撑结构[3]。作者发现以DCN⁺和APOD⁺为标志的两组血管周围成纤维细胞（图1 H-I），没有发现其他脑成纤维细胞的标记物，证实了成人大脑中存在血管周围成纤维细胞。根据外周动脉（如主动脉和颈内颈动脉）中收缩蛋白（TAGLN和ACTA2）的低表达以及成纤维细胞（DCN和LUM）和巨噬细胞（LGALS3）基因的高表达，作者将细胞群鉴别为“纤维肌细胞”[15-17]。差异基因表达鉴定出IGFBP5、KCNT2和CCL19对纤维肌细胞更有特异性，在皮层验证了KCNT2⁺和CCL19⁺纤维肌细胞的存在（图2 A-C），但之前的小鼠细胞图谱中未发现这种特征[3,9-10]，表明人的脑血管存在纤维肌细胞。在脑纤维肌细胞簇和血管周围成纤维细胞中富集维甲酸合成酶和受体基因表达（图1 I），在空间上分别证实了ALDH1A1和RARA在DCN⁺血管周围成纤维细胞和CCL19⁺纤维肌细胞中的表达（图2 B-C）。因此，纤维肌细胞和血管周围成纤维细胞可能是成人大脑中维甲酸的内源性来源。

图2 空间RNA分析

（图源：Ethan A. Winkler, et al., Science, 2022）

接下来为了验证数据的实用性，作者通过血管造影手术从5名动静脉畸形（arteriovenous malformation，AVM）患者中采集到脑组织，从106853个细胞生成高质量的全细胞转录组数据，确定了11个主要细胞群（图3 B-C）。并从空间上验证了AVMs中CLDN5⁺内皮细胞、TAGLN⁺ SMCs、CCL19⁺纤维肌细胞和COL1A2⁺血管周围成纤维细胞（图3 D）。为了确定AVMs中内皮细胞和血管周围细胞的分子变化，作者识别对照组和AVM 的差异表达基因（图3 E-F），鉴定出AVMs中异常的基因表达和细胞特异性模式。AVMs是由于内皮细胞的病理分子改变[19-20]，诱导动脉和静脉之间形成直接连接，并导致弯曲的、畸形的血管缠结，称为“病灶”[18]。对照和AVM数据集的联合分析显示，在AVM中，内皮细胞亚群在动脉和静脉较丰富（图3 E, G），在小静脉和毛细血管细胞受到抑制（主要表现为Nd1和Nd2的基因表达差异）（图3 H）。通过基因组富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），AVM中内皮细胞的Nd2富集可能会导致如血管生成、炎症和上皮-间质转化等致病性级联反应（图3 J）[21-22]。对照组毛细血管内皮细胞高表达血脑屏障营养转运蛋白，包括MFSD2A、SLC16A1和SLC38A5（图3 K），而AVM Nd2内皮细胞抑制了营养转运蛋白的表达，上调了促炎基因（CCL14）、促血管生成基因（PGF和STC1）和促通透性基因（PLVAP和ANGPT2）（图3 K-L）。此外，在AVM淋巴结中也验证了Nd2内皮细胞的定位（图3 M）。

 图3 畸形脑血管中的细胞异常现象

（图源：Ethan A. Winkler, et al., Science, 2022）

炎症可能在AVMs的形成中起重要作用[18,23]。对与脑血管相关的免疫细胞群进行迭代分析后发现17个免疫细胞群（图4 A-B），其中9个免疫细胞群由髓样细胞组成，包括血管相关小胶质细胞、常规树突状细胞（conventional dendritic cells，cDCs），3个为血管周围巨噬细胞（perivascular macrophage， pvMφ）亚群，3个为单核细胞（monocyte，Mo）亚群。此外，分离了有体外激活证据的髓系细胞（conventional dendritic cells，ExV）[24]可发现，8个淋巴细胞群由CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞亚群、调节性T细胞（Treg）、B细胞、自然杀伤细胞（NK）、浆细胞样树突状细胞（pDCs）组成，以及由Treg细胞组成的分裂淋巴细胞群（dividing lymphocytes，Div）（图4 A-B）。pvMφs是最丰富的免疫细胞群，分别占对照组和AVMs免疫细胞的31.2%和28.3%（图4 C）。大于90%的循环免疫细胞，如CD8 ⁺ T细胞，被限制在静止的脑血管系统内，但在AVMs中，它们会渗透到血管周的空间或相邻的区域 ，骨髓免疫细胞更丰富也提示了其可能在AVMS中激活（图4 D-G）。血管相关CD11c⁺抗原提呈细胞是脑CD4⁺ T细胞原位反应的有效激活因子[25-26]。本结果中观察到血管相关CD11c⁺细胞由髓样细胞组成，包括 cDCs、pvMφs和一些小胶质细胞，在AVM病灶中发现了血管相关抗原呈递髓样细胞的异质性空间分布（图4 F），离散领域有更多的IBA1⁺ P2RY12^-巨噬细胞或IBA1 ⁺ P2RY12⁺小胶质细胞。AVM中观察到明显的血管周围骨髓细胞反应，IBA1⁺P2RY12⁻巨噬细胞在离血管较远的地方存在，这与AVMs的浸润现象一致（图4 G）。因此，在AVM中存在多种细胞和空间异质性的脑血管炎症反应。

图4 脑血管炎症与畸形

（图源：Ethan A. Winkler, et al., Science, 2022）

接下来作者试图确定与AVM破裂相关的有害细胞状态。利用Bulk RNA sequencing、scMappR等计算分离出39个未破裂的AVM和26个破裂的AVM （图5 A）[27]。发现了与AVM破裂相关的871个差异基因表达，它们富集在血管发育途径（如血管发育和形态发生）和炎症过程（如细胞募集）中。在破裂的AVMs中大量出现AIF1⁺（编码IBA1），P2RY12⁻单核细胞亚群，GPNMB⁺ Mo3单核细胞（图5 B, D）。提示AVM破裂后明显增强了免疫细胞的浸润状态。炎症导致血管完整性的丧失，SMCs耗尽后导致脑出血，破裂AVMs中GPNMB⁺单核细胞和SMCs的丰度呈负相关[23,28]。因此，作者接下来研究了GPNMB⁺单核细胞是否与SMC死亡有关。从破裂AVM中分离的GPNMB⁺单核细胞与原发性脑血管SMCs （VSMCs）共培养增加了凋亡的裂解caspase-3⁺VSMCs（图5 E）。SPP1（编码骨桥蛋白（osteopontin，OPN））是AVMs中GPNMB⁺单核细胞中最大的失调输出信号通路（图5 F）。配体OPN被证明与SMCs上的CD44和整合素受体相互作用[29]。可溶性OPN诱导VSMC细胞增加2.7倍的凋亡，而中和CD44抗体、整合素抑制剂可改善VSMC细胞凋亡（图5 G）。这些结果提示GPNMB⁺单核细胞有助于SMC的消耗，并与AVM破裂和脑出血相关。

 图5 脑动静脉畸形破裂的细胞状态

（图源：Ethan A. Winkler, et al., Science, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

本文提供了人类成人脑血管系统转录组的基础细胞功能和相互作用图谱，确定了对动静脉表型改变和扩大脑细胞周围血管细胞多样性至关重要的内皮分子分区，包括之前未在脑血管系统中发现的纤维肌细胞[3,9-10]。该图谱对神经科学和临床医学具有重要意义，为未来在其他脑区域或脑血管疾病的研究提供信息，以加速对人类脑血管系统的机制理解和治疗靶向。但这个图谱只是全面普查人类脑血管的第一步，由于细胞捕获、分离和随机抽样等非预期偏差的限制，可能会改变相对细胞比例，需要进一步在空间范围的数据集中进行验证，并且还需要确定细胞类型和细胞状态之间的区别，例如瞬态或代谢变化等。

原文链接：https://doi.org/10.1093/cercor/bhac017

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制版︱王思珍

本文完